Konstruerede klapper kræver et indbygget funktionelt vaskulært netværk. I denne protokol præsenterer vi en metode til fremstilling af en 3D-printet vævsklap indeholdende et hierarkisk vaskulært netværk og dets direkte mikrokirurgiske anastomoser til rotte lårbensarterie.
Engineering implanterbare, funktionelle, tykke væv kræver design af et hierarkisk vaskulært netværk. 3D-bioprinting er en teknologi, der bruges til at skabe væv ved at tilføje lag på lag af printbare biomaterialer, såkaldte bioinks og celler på en ordnet og automatisk måde, hvilket giver mulighed for at skabe meget indviklede strukturer, som traditionelle vævstekniske teknikker ikke kan opnå. Således er 3D-bioprinting en tiltalende in vitro-tilgang til at efterligne den oprindelige vaskulaturkompleksstruktur, der spænder fra millimetriske kar til mikrovaskulære netværk.
Fremskridt inden for 3D-bioprinting i granulære hydrogeler muliggjorde ekstrudering af ekstracellulære matrixbaserede bioinks med høj opløsning. Dette arbejde præsenterer en kombineret 3D-bioprinting og offerformbaseret 3D-printtilgang til fremstilling af manipulerede vaskulariserede vævsflapper. 3D-bioprinting af endotel- og støtteceller ved anvendelse af rekombinant kollagen-methacrylatbioink i et gelatinestøttebad anvendes til fremstilling af et selvsamlet kapillærnetværk. Denne trykte mikrovaskulatur er samlet omkring et mesoskala karlignende porøst stillads, fremstillet ved hjælp af en offer 3D-trykt form og er podet med endotelceller.
Denne samling inducerer endotelet i mesoskalabeholderen til anastomose med det omgivende kapillærnetværk, hvilket etablerer et hierarkisk vaskulært netværk inden for en konstrueret vævsklap. Den konstruerede klap implanteres derefter direkte ved kirurgisk anastomose til en rotte lårbensarterie ved hjælp af en manchetteknik. De beskrevne metoder kan udvides til fremstilling af forskellige vaskulariserede vævsflapper til brug i rekonstruktionskirurgi og vaskulariseringsundersøgelser.
Alvorlige vævsdefekter er forårsaget af traumatiske skader, medfødte defekter eller sygdom, og den nuværende guldstandard til behandling af disse defekter er ved hjælp af autologe transplantater, vaskulariserede vævsflapper og mikrovaskulære frie klapper som vævserstatninger. Disse muligheder har imidlertid ulemperne ved begrænset donorstedsvæv og donorsteds sygelighed1. Der er således en stigende efterspørgsel efter alternative vævserstatninger, der kan bruges til at rette op på disse defekter2. Tykkelsen af de konstruerede vævskonstruktioner er begrænset af diffusion af næringsstoffer og gasser mod cellerne, og derfor er et ordentligt vaskulært netværk afgørende for at generere store, tykke og korrekt nærede stilladser.
Der er anvendt flere metoder til at fremme vaskularisering af konstruerede implantater3, herunder in vivo-rekruttering af vaskulær støtte fra værten, levering af vækstfaktorer og cytokiner i stilladserne, prævaskularisering af implantater, generering af et perfusabelt forgreningsmikroskib ved hjælp af mikropatterningsteknikker4, anvendelse af offermaterialer til vaskulær kanal/ netværksdannelse5 , samt oprettelse af kanaler inden for 3D bioprintede konstruktioner 5,6. Vaskularisering af tykke væv kræver inkorporering af et hierarkisk vaskulært netværk bestående af makroskala og mikrokapillærskala fartøjer. Makroskalakarrene fordeler blod effektivt gennem hele konstruktionen og tillader mikrokirurgiske anastomoser med værtsblodkarrene, mens mikrokapitalskalakarrene giver mulighed for næringsdiffusion.
Bioprinting har fået stor opmærksomhed i de senere år på grund af de fordele, det giver i forhold til konventionelle vævstekniske metoder. Væv og organer er komplekse og indviklede 3D-objekter med en bestemt arkitektur. 3D-bioprinting med dets evne til at deponere lag af biomaterialer i høj opløsning gør det muligt at skabe komplekse vævs- og organsubstitutter (f.eks. nyre, lunge, lever)7. Flere udskrivningsteknologier er blevet tilpasset til bioprinting, herunder ekstruderingsbaseret, inkjet8, laserassisteret deposition 9,10 og stereolitografibaseret11,12 bioprinting. De ekstruderingsbaserede teknologier er afhængige af ekstrudering af materialet gennem en dyse ved at lægge pres på materialets bulkoverflade modsat dysen.
Fri form reversibel indlejring af suspenderede hydrogeler (FRESH) er en bioprintteknik13,14, der bruger et granulært støttemateriale, hvor det ekstruderede materiale deponeres og fastgøres på plads af støttebadet. Støttebadet giver mekanisk støtte til den ekstruderede, forkrydsede bioink indtil dens tværbinding. Den største fordel ved denne teknik er, at støttebadet giver mulighed for ekstrudering af materialer med lav viskositet, der ikke kan opretholde deres form efter ekstrudering og før tværbinding15. Dette udvider puljen af tilgængelige materialer, der kan bruges som bioinks.
Dette papir præsenterer en protokol til generering af en vaskulariseret klap, der kombinerer mikroskala og mesoskala vaskulaturer. For at opnå dette genereres bioprintede, selvsamlende, mikrovaskulære netværk i rekombinant human kollagenmethacrylat (rhCollMA) hydrogel, som derefter forbinder til det indre af et større, implanterbart, vaskulært stillads, hvilket resulterer i en fuldt konstrueret vævsklap16. For at etablere hurtig og direkte perfusion af manipulerede væv kræves en direkte mikrokirurgisk anastomose til værtsfartøjer. Det vaskulære stillads har ikke tilstrækkelig suturretentionsstyrke til at blive anastomoseret ved hjælp af traditionel mikrokirurgisk karvægsuturering. Derfor beskriver vi en “manchet”17,18,19 metode til at opnå en anastomose med en rottes fælles lårbensarterie. I denne metode sikres fartøjets ender med perifere suturer uden behov for at perforere karvæggen.
Selvom den foreslåede protokol er udarbejdet for at studere hierarkisk vaskulatur i rhCollMA-miljøet, kan denne tilgang udvides og anvendes på en række nye applikationer. Protokollen kan anvendes til bioprinting af forskellige vævsspecifikke celler i forskellige bioinks. Desuden kan konstruktionernes geometri og størrelse let ændres, så de passer til specifikke krav, såsom rekonstruktion af stort væv eller biologiske undersøgelser.
Engineering vaskulariserede væv er en af de største udfordringer ved vævsteknik20. Nuværende metoder til fremstilling af konstrueret vaskulært væv fokuserer på at skabe selvsamlet mikrovaskulatur21,22,23 eller fremstilling af mesoskala vaskulære stilladser24,25 og ikke på genskabelse af et system af hierarkisk vaskulatur, som kan perfunderes straks og direkte ved implantation26 . I dette arbejde beskriver vi en protokol, der gør brug af to 3D-printmodaliteter til at fremstille et hierarkisk fartøjsnetværk sammensat af mikroskala og mesoskala vaskulaturer. Protokollen kombinerer et 3D bioprintet, selvsamlet mikrovaskulært netværk med et mesoskala vaskulært stillads, der opnår en implanterbar, vaskulariseret klap. Desuden præsenterer dette papir en protokol til direkte anastomosering af denne klap til en rottes lårbensarterie.
3D-bioprinting har fået interesse i de senere år på grund af dets alsidighed over traditionelle vævstekniske teknikker. Mens denne protokol beskriver dannelsen af et mikrovaskulært netværk i rhCollMA bioink, kan de anvendte metoder anvendes med få ændringer på mange andre bioinks fra overfloden af studerede og nye bioinks og støttebade27,28. Vi valgte at bruge rhCollMA som bioink på grund af overfloden af type I kollagen i den humane ECM, hvilket giver et passende miljø til cellebinding. Desuden produceres det rekombinant i planter og modificeres yderligere med methacrylatgrupper, hvilket muliggør fotopolymerisering og dannelse af stabile 3D-hydrogeler29,30. Photocrosslinking blev opnået ved tilsætning af fotoinitiatoren LAP, som har vist sig at være giftfri og aktiveres ved udsættelse for 405 nm blåt lys, hvilket reducerer den mulige fototoksicitet af UV-lys. Anvendelsen af lysfølsomme bioinks nødvendiggør imidlertid anvendelse af et phenolrødfrit kulturmedium til fremstilling af bioink og støttematerialet. Desuden beskriver protokollen brugen af gelatinestøttemateriale, som muliggør ekstrudering af bioinks såsom rhCollMA med høj nøjagtighed. Det er således afgørende at sikre brugen af koldt medium under dets forberedelse og afkøling af printerlejet. Overdreven opvarmning kan forekomme på grund af den lyskilde, der bruges til tværbinding eller fra forhøjede omgivelsestemperaturer.
En ekstruderingsbaseret bioprinter er blevet brugt her til at skabe det bioprintede mikrovaskulære netværk, og der er i øjeblikket mange kommercielt tilgængelige bioprintere, der kan generere lignende konstruktioner. Desuden kan de foreslåede metoder let ændres og anvendes til at studere forskellige geometrier, størrelser og udfyldningsmønstre. I dette arbejde blev der valgt et retlinet udfyldningsmønster for at skabe sammenkoblede porer, og dette kan udskrives relativt hurtigt med høj troskab.
Luftbobler introducerer en betydelig udfordring i ekstruderingsbioprint, især inden for støttematerialer. Derfor er det afgørende at minimere tilstedeværelsen og dannelsen af disse bobler ved at anvende positive forskydningspipetter til overførsel af støttematerialet, fremstilling af bioinkcellesuspensionen og deres overførsel til trykpatronerne.
I dette arbejde blev humane fedtafledte endotelceller og tandmasse stamceller anvendt som støtteceller på grund af deres relativt lette isolering fra patienter. Desuden blev der valgt en samlet cellekoncentration på 8 x 106 celler / ml, da denne koncentration har vist sig at etablere de mest udviklede vaskulære netværk16. Mens denne protokol kan anvendes til at generere mikrovaskulatur ved hjælp af forskellige celletyper og kilder samt forskellige bioinks, skal der foretages en kalibrering af cellekoncentration for at etablere de bedste betingelser for udviklingen af det mikrovaskulære netværk. Desuden kan vævsspecifikke celler (dvs. myoblaster eller osteoblaster) inkorporeres i bioink for at opnå vævsspecifikke vaskulariserede klapper.
Formen til det porøse vaskulære stillads blev fremstillet ved hjælp af 3D-printet vandopløseligt materiale på en kommercielt tilgængelig ekstruderings-3D-printer. Dette resulterer i en omkostningseffektiv teknik baseret på rapid prototyping platforme, således at mange forskellige geometrier og størrelser af vaskulære stilladser kan studeres og screenes hurtigt31. Ikke desto mindre er en begrænsning af denne metode opløsningsgrænsen for de fleste 3D-printere32. Men med den hurtigt udviklende industri omkring additiv fremstilling forventes disse grænser at blive forbedret over tid. Anvendelsen af organiske opløsningsmidler til fremstillingsprocessen er en anden begrænsning af protokollen, da de fleste organiske opløsningsmidler er giftige for celler, hvilket forhindrer evnen til at kombinere bioprintproceduren med vaskulær stilladsfremstillingsprocessen.
Den beskrevne metode til såning af stilladsets lumen ved hjælp af aspiration i modsætning til at skubbe cellesuspensionen har store virkninger på lokaliseringen af de podede celler. Brug af undertryk muliggør endotelisering af stilladsets indre lumen, samtidig med at enhver spild af celleophænget minimeres gennem perforeringerne på stilladsets væg16.
Den beskrevne “manchet” -metode til mikrokirurgiske anastomoser kan let ændres og tilpasses forskellige vaskulære stilladsmaterialer eller størrelser samt til forskellige arterier og vener i en bred skala af dyremodeller. Tilpasningerne til protokollen ville omfatte forskellige polyimidrørstørrelser og suturstørrelser. Denne metode kræver ikke perforering af stilladsvæggen, hvilket kan føre til udvikling af defekter. Dette arbejde præsenterer en protokol, der kan udvides til mange applikationer. De kritiske aspekter af denne protokol, som omfatter fremstilling af meso- og mikroskala vaskulatur og deres samling og implantation, repræsenterer kritiske aspekter af konstruerede klapper både til rekonstruktive applikationer samt vaskulære og andre vævstekniske undersøgelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt modtog støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EU’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram (tilskudsaftale nr. 818808). rhCollMA blev generøst leveret af CollPlant (Rehovot, Israel). Forfatterne takker Technions prækliniske forskningsmyndighed for hjælpen med dyrepleje samt Janette Zavin, Galia Ben David og Idan Redenski.
1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
Acland clamps | S&T | B-1V | |
Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
Duratears | Alcon | DJ03 | |
ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | – | |
Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
NEAA | Gibco | 11140068 | |
Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
Scalpel handle – #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |