वर्तमान प्रोटोकॉल टोमो 5 का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी रिमोट डेटा अधिग्रहण का वर्णन करता है और बाद में डेटा प्रोसेसिंग और सबटोमोग्राम औसत का उपयोग करके ईएमक्लारिटी का उपयोग करता है। एपोफेरिटिन का उपयोग 2.86 ए रिज़ॉल्यूशन पर क्रायो-ईटी संरचना प्राप्त करने के लिए विस्तृत चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं को चित्रित करने के लिए एक उदाहरण के रूप में किया जाता है।
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) हाल के वर्षों में गति प्राप्त कर रहा है, खासकर प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों की शुरूआत के बाद से, स्वचालित अधिग्रहण रणनीतियों में सुधार, तैयारी तकनीकें जो क्रायो-ईटी और नए सबटोमोग्राम औसत सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप क्या छवि कर सकती हैं, इसकी संभावनाओं का विस्तार करती हैं। इसके अतिरिक्त, डेटा अधिग्रहण तेजी से सुव्यवस्थित हो गया है, जिससे यह कई उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ हो गया है। सार्स-सीओवी-2 महामारी ने रिमोट क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) डेटा संग्रह को और तेज कर दिया है, विशेष रूप से वैश्विक स्तर पर कई सुविधाओं में सिंगल-पार्टिकल क्रायो-ईएम के लिए, महामारी के दौरान अत्याधुनिक उपकरणों तक निर्बाध उपयोगकर्ता पहुंच प्रदान करता है। टोमो 5 (3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर) में हालिया प्रगति के साथ, रिमोट क्रायो-ईटी डेटा संग्रह दुनिया में कहीं से भी मजबूत और संभालना आसान हो गया है। इस आलेख का उद्देश्य विस्तृत समस्या निवारण के साथ (दूरस्थ) क्रायो-ईटी डेटा संग्रह सत्र की प्रक्रिया के लिए टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर में डेटा संग्रह सेटअप से शुरू होने वाला एक विस्तृत वॉक-थ्रू प्रदान करना है। (रिमोट) डेटा संग्रह प्रोटोकॉल को एक उदाहरण के रूप में एपोफेरिटिन का उपयोग करके, ईएमक्लैरिटी के साथ औसत सबटोमोग्राम द्वारा निकट-परमाणु रिज़ॉल्यूशन पर संरचना निर्धारण के लिए वर्कफ़्लो के साथ पूरक किया जाता है।
क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को व्यापक रूप से पुनर्जागरण अवधि का अनुभव करने के लिए जाना जाता है, जो इसे संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक मुख्य और केंद्रीय रूप से उपयोगी उपकरण बनने के लिए तेज करता है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों का विकास और उपयोग 1,2,3, बेहतर माइक्रोस्कोप और इलेक्ट्रॉन स्रोत 3,4,5, स्वचालन / थ्रूपुट में सुधार 6,7,8,9, और एकल-कण विश्लेषण में कम्प्यूटेशनल प्रगति 10,11,12,13 14 और टोमोग्राफी 15,16,17 सभी, भाग में, तकनीक की हालिया सफलता के लिए जिम्मेदार हैं। इन तकनीकी ड्राइवरों ने क्रायोजेनिक और देशी परिस्थितियों में जैविक मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को हल करने के लिए क्रायो-ईएम की क्षमता विकसित की है। जो संकल्प आसानी से प्राप्य हैं, वे परमाणु रूप से सटीक मॉडलिंग के लिए पर्याप्त हैं और तकनीक को संरचनात्मक जीव विज्ञान क्षेत्र में सबसे आगे लाए हैं। ब्याज के जैविक लक्ष्य को व्यक्त करने और शुद्ध करने के लिए एक न्यूनतावादी दृष्टिकोण लंबे समय से बुनियादी जैविक अनुसंधान, दवा की खोज और अनुवाद विज्ञान के लिए मैक्रोमोलेक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एमएक्स) में सफल साबित हुआ है। उसी दृष्टिकोण में, क्रायो-ईएम अब परिणाम प्रदान कर सकता है जो समानांतर उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएक्स अध्ययन करता है। संरचनात्मक जीव विज्ञान की क्रायो-ईएम शाखा में वर्तमान प्रमुख सफलता को एकल कण विश्लेषण (एसपीए) कहा जाता है, जो जैविक मैक्रोमोलेक्यूल19 के हजारों विचार प्राप्त करने के लिए आमतौर पर शुद्ध प्रोटीन नमूना18 की 2 डी प्रक्षेपण छवियों का अधिग्रहण करता है। इन छवियों (1) में कई दृश्यों से जानकारी होती है जो पूरी तरह से 3 डी स्पेस में लक्ष्य के झुकाव का प्रतिनिधित्व करती हैं और (2) ऑब्जेक्ट विरूपण विषमता को कैप्चर करती हैं, जिसे बाद में अलग और जांच की जा सकती है।
जैविक नमूनों की इन 2 डी प्रक्षेपण छवियों को प्राप्त करने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण, यहां तक कि सीटू में और शुद्धिकरण के बिना, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-ईटी) है। क्रायो-ईटी यांत्रिक रूप से नमूने को घुमाकर झुके हुए कोणों पर एक ही वस्तु की छवियों की एक श्रृंखला लेता है। इस प्रकार, एसपीए में एकत्र किए गए 2 डी अनुमान, ब्याज के अणु के कोणीय पोज़ का प्रतिनिधित्व करते हैं, स्वाभाविक रूप से क्रायो-ईटी इमेजिंग प्रयोग20 के हिस्से के रूप में एकत्र किए जाते हैं। टोमोग्राफिक झुकाव श्रृंखला को तब एक टोमोग्राम में पुनर्निर्मित किया जाता है जिसमें इमेज किए गए मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी अभ्यावेदन होते हैं। टोमोग्राफिक डेटा संग्रह की प्रकृति, एक डिग्री तक, 2 डी छवियों के संग्रह से एक अणु के पूर्ण 3 डी प्रतिनिधित्व को प्राप्त करने के लिए औसत पर निर्भरता को कम करती है। हालांकि, वर्तमान चरण डिजाइनों के कारण, नमूना आमतौर पर -60 ° से +60 ° तक झुका हुआ होता है, जिससे टोमोग्राफिक 3 डी पुनर्निर्माण में जानकारी का एक लापता पच्चर21 छोड़ दिया जाता है।
एक ही टोमोग्राम में 3 डी पुनर्निर्माण में तब सूचना का एक लापता पच्चर और शोर के लिए कम संकेत होता है। व्यक्तिगत मैक्रोमोलेक्यूल्स को सबटोमोग्राम के रूप में निकाला जा सकता है और इससे निपटने के लिए एक साथ औसत किया जा सकता है। जहां एक सबटोमोग्राम में प्रत्येक मैक्रोमोलेक्यूल एक अलग अभिविन्यास पर पाया जाता है, लापता पच्चर लक्ष्य वस्तु के प्रत्येक सबटोमोग्राम में अलग-अलग उन्मुख होता है, इसलिए कई प्रतियों पर औसतन लापता पच्चर के कारण जानकारी भरता है। छवि प्रसंस्करण में हाल के घटनाक्रमों ने सार्थक डेटा22 के साथ लापता पच्चर को भरने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता तंत्रिका नेटवर्क को प्रशिक्षित करने का भी प्रयास किया है। यह औसत प्रक्रिया शोर के संकेत को भी बढ़ाती है, एकल कण विश्लेषण में औसत के लक्ष्य के समान, इसलिए पुनर्निर्माण की गुणवत्ता और संकल्प में सुधार होता है। यदि ब्याज के अणु में समरूपता होती है, तो उसे भी औसत के दौरान परिभाषित और नियोजित किया जा सकता है, जिससे पुनर्निर्माण संकल्प में और सुधार हो सकता है। एक टोमोग्राम से सबटोमोग्राम के एक सेट में मैक्रोमोलेक्यूल के 3 डी वॉल्यूम की निकासी और उनके बाद के प्रसंस्करण को सबटोमोग्राम एवरेजिंग (एसटीए) 23 के रूप में जाना जाता है। जहां प्रत्येक सबटोमोग्राम अध्ययन किए जा रहे अणु की एक अनूठी प्रति का प्रतिनिधित्व करता है, एसटीए वर्कफ़्लो का उपयोग करके किसी भी संरचनात्मक विषमता से पूछताछ की जा सकती है। जैसा कि आमतौर पर एसपीए वर्कफ़्लो में उपयोग किया जाता है, एसटीए के दौरान ब्याज के परिसर के विरूपण राज्यों को विच्छेदित करने के लिए वर्गीकरण तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है। साथ ही एसटीए क्रायो-ईटी में उच्च-रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण को सक्षम करता है, यह दृष्टिकोण तकनीक को अपने मूल सेलुलर वातावरण में मैक्रोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाता है या लक्ष्यों को अक्सर एसपीए 24,25,26 के लिए उत्तरदायी नहीं होता है।
इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी में कमरे के तापमान27 पर सेलुलर नमूनों के 3 डी अल्ट्रास्ट्रक्चर का निर्धारण करने का एक लंबा इतिहास है। नमूने के भौतिक झुकाव द्वारा विचारों का अधिग्रहण सेलुलर-लंबाई के तराजू पर किसी वस्तु के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए पर्याप्त जानकारी प्रदान करता है और विशेष रूप से महत्वपूर्ण होता है जब सेलुलर संरचनाओं में औसत के लिए नियमितता की कमी होती है। कोशिकाओं को सेल किनारों पर क्रायो-ईटी इमेजिंग के लिए सब्सट्रेट पर भी जमे हुए किया जा सकता है जहां नमूना इलेक्ट्रॉन पारदर्शी होने के लिए पर्याप्त पतला होता है। इन शर्तों के तहत, एसटीए को सेलुलर वातावरण में मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, यद्यपि जब नमूना इलेक्ट्रॉन पारदर्शी होने के लिए पर्याप्त पतलाहोता है 28. हालांकि, क्रायो-कोरिलेटिव लाइट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-सीएलईएम) और केंद्रित आयन बीम मिलिंग (क्रायो-एफआईबी) सहित अतिरिक्त तैयारी तकनीकों के साथ संयुक्त होने पर, क्रायो-ईटी का उपयोग क्रायोजेनिक स्थितियों29 के तहत पूरी कोशिकाओं के अंदर छवि के लिए किया जा सकता है। यह एसटीए की शक्ति के साथ सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर का अध्ययन करने के लिए क्रायो-ईटी की शक्ति को एक साथ लाता है ताकि उनके सेलुलर स्थान30 की पहचान करते हुए सीटू में मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को निर्धारित किया जा सके और गतिशील प्रक्रियाओं में लगे परिसरों के स्नैपशॉट प्रदान किएजा सकें। सेलुलर नमूनों की छवि बनाने और कई अध्ययनों में एसटीए को नियोजित करने की तकनीक की क्षमता ने सीटू में मैक्रोमोलेक्यूलर संरचनाओं को हल करने के लिए तकनीक की शक्ति पर प्रकाश डाला है, यहां तक कि एसपीए32 की तुलना में संकल्पों पर भी। एक और लाभ मैक्रोमोलेक्यूल के मूल स्थान के ज्ञान में पाया जाता है, जो टोमोग्राम30 में अंतिम वर्गीकृत 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा दर्शाया गया है। इसलिए, मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना को सेलुलर अल्ट्रास्ट्रक्चर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है। लंबाई के तराजू में ये टिप्पणियां संभवतः महत्वपूर्ण निष्कर्षों को जन्म देंगी जहां संरचनात्मक तंत्र कार्यात्मक अध्ययनों के संदर्भ में सेलुलर परिवर्तनों के साथ सहसंबद्ध हो सकते हैं।
क्रायो-ईटी और एसटीए तीन प्रमुख वर्कफ़्लो में डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं: आणविक, सेलुलर और लैमेला टोमोग्राफी। शुद्ध मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स की संरचनाओं को आणविक टोमोग्राफी द्वारा क्रायो-ईटी द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। उनके सेलुलर वातावरण में प्रोटीन संरचनाओं का निर्धारण जहां कोशिका काफी पतली होती है, सेलुलर टोमोग्राफी के रूप में वर्णित किया जा सकता है। हाल ही में, क्रायोजेनिक लक्ष्यीकरण और मिलिंग के विकास के साथ, इन समान तकनीकों को लैमेला टोमोग्राफी वर्कफ़्लो में अपने मूल वातावरण में कोशिका के अंदर गहरे प्रोटीन संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि सेलुलर संदर्भ का खुलासा करते हुए जिसमें उन प्रोटीनों को देखा जाता है। उपलब्ध सॉफ़्टवेयर पैकेजों के आधार पर विभिन्न डेटा संग्रह रणनीतियों का उपयोग किया जा सकता है और सबसे महत्वपूर्ण बात, नमूने की आवश्यकता के आधार पर। शुद्ध प्रोटीन के तांबे के टीईएम ग्रिड पर आणविक या गैर-अनुयायी नमूनों को आमतौर पर कम हैंडलिंग की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, आदर्श मामलों में फ्लैट और अक्षतिग्रस्त रहते हैं। इलेक्ट्रॉन टोमोग्राम को आसानी से एक छेद-कार्बन ग्रिड में श्रृंखला में स्थापित किया जा सकता है ताकि व्यवस्थित तरीके से दसियों से सैकड़ों टोमोग्राम को जल्दी से प्राप्त किया जा सके। उपयोगकर्ताओं के लिए आणविक टोमोग्राफी नमूने स्थापित करने का सबसे आसान तरीका जहां ग्रिड पर प्रोटीन प्रचुर मात्रा में मौजूद हैं, टोमो 5 (वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करना होगा। अन्य टोमोग्राफी सॉफ्टवेयर जैसे कि लेगिनॉन9 और सीरियलईएम6 भी उपलब्ध हैं; वे डेटा संग्रह के लिए अधिक व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए अधिक सेटअप विकल्प प्रदान करते हैं लेकिन अधिक जटिल हैं और परिणामस्वरूप नेविगेट करना कठिन हो सकता है, विशेष रूप से टोमोग्राफी के लिए नए उपयोगकर्ताओं और दूरस्थ रूप से अपने सत्र तक पहुंचने वाले उपयोगकर्ताओं के लिए। एक बड़े और विविध उपयोगकर्ता आधार के साथ एक सुविधा के लिए, टोमो 5 दूरस्थ वातावरण में संचालित करना और उपयोगकर्ताओं को प्रशिक्षित करना आसान है। अनुयायी कोशिकाओं के लिए, ग्रिड को आमतौर पर अधिक हैंडलिंग चरणों की आवश्यकता होती है, और नाजुक सोने के ग्रिड का उपयोग करने की आवश्यकता हैंडलिंग और डेटा संग्रह रणनीतियों में बेहतर देखभाल की आवश्यकता को बढ़ाती है। ब्याज के एक सेलुलर क्षेत्र को खोजने की सुविधा के लिए और उच्च झुकाव कोणों पर ग्रिड से रोड़ा से बचने के लिए, बड़े जाल आकारों का उपयोग करना भी फायदेमंद है, लेकिन इस कीमत पर कि वे स्वाभाविक रूप से अधिक नाजुक हैं। लैमेला नमूनों के लिए, नमूने की नाजुकता लैमेला की गुणवत्ता से निर्धारित होती है, जो परिवर्तनशील हो सकती है। ये कारक सेटअप समय और विचारों को बढ़ाते हैं, लेकिन बढ़ी हुई अनुकूलनशीलता और मजबूती फिर से टोमो 5 को इस प्रकार के डेटा संग्रह के लिए उपयुक्त बनाती है। हालाँकि, प्रत्येक वर्कफ़्लो के लिए विशेष डेटा संग्रह परिदृश्य मौजूद हैं। बिसेक्ट और पेस-टोमो (दोनों सीरियलईएम में चलते हैं) टोमोग्राफी अधिग्रहण के दौरान विशेष रूप से आणविक टोमोग्राफी में टोमोग्राम संग्रह गति 28 बढ़ाने के लिए स्क्रिप्टेड बीम-इमेज शिफ्टिंग की संभावना का परिचयदेते हैं। सीरियलईएम 6,7,33 में मध्यम आवर्धन असेंबल (एमएमएम) सभी वर्कफ़्लो में आणविक सुविधाओं को बेहतर ढंग से पहचान और सटीक रूप से लक्षित कर सकते हैं, हालांकि, लेखन के समय, इन सुविधाओं को टोमो 5 में लागू किया जाना शुरू हो रहा है।
एसपीए की तरह, क्रायो-ईटी और एसटीए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में किए गए सुधारों और सबटोमोग्राम के लिए उपलब्ध पैकेजों का खजाना औसतन 16,17,32,34,35,36,37,38 के माध्यम से तेजी से सुलभ हो रहे हैं। इसके अलावा, महामारी के दौरान, डायमंड लाइट सोर्स (डीएलएस), यूके में इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) जैसी राष्ट्रीय सुविधाओं के निरंतर संचालन के लिए क्रायो-ईएम इंस्ट्रूमेंटेशन तक दूरस्थ पहुंच को सक्षम करना आवश्यक हो गया। इन घटनाओं ने क्रायो-ईटी को तकनीक का उपयोग करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए अधिक सुलभ और मजबूत बना दिया है। एक बार डेटा प्राप्त हो जाने के बाद, एसटीए अधिकतम रिज़ॉल्यूशन पुनर्निर्माण प्राप्त करने और मैक्रोमोलेक्यूलर विषमता के वर्गीकरण की अनुमति देने के लिए आवर्तक वस्तुओं का विश्लेषण करने के लिए एक आवश्यक उपकरण है। वर्तमान प्रोटोकॉल का उद्देश्य क्रायो-ईटी डेटा संग्रह के लिए क्रायो-टीईएम माइक्रोस्कोप तैयार करने का एक विस्तृत वॉक-थ्रू प्रदान करना है और उदाहरण के रूप में एपोफेरिटिन के आणविक टोमोग्राफी डेटासेट पर ईएमक्लैरिटी का उपयोग करके सबटोमोग्राम औसत कैसे किया जाए। ईएमक्लैरिटी (उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और सबटोमोग्राम औसत के लिए सॉफ्टवेयर, सामग्री की तालिका देखें) के उपयोग के लिए कमांड लाइन से स्क्रिप्ट चलाने की आवश्यकता होती है, इसलिए लिनक्स / यूनिक्स सिस्टम के साथ परिचितता का स्तर माना जाता है।
दूरस्थ कनेक्शन प्रत्येक संस्थान/सुविधा में नेटवर्क वातावरण पर निर्भर करता है। ईबीआईसी में, रिमोट सिस्टम उन प्रोग्रामों का उपयोग करता है जो डायमंड में उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट नेटवर्क कॉन्फ़िगरेशन पर दूरस्थ डेटा संग्रह की अनुमति देते हैं। माइक्रोस्कोप के लिए रिमोट कनेक्शन दो प्लेटफार्मों द्वारा सुविधाजनक है: नोमशीन और टीमव्यूअर ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रोग्राम NoMachine का उपयोग करके, उपयोगकर्ता दूरस्थ विंडोज डेस्कटॉप पर लॉग ऑन कर सकता है। नोमशीन द्वारा प्रदान किया गया रिमोट विंडोज डेस्कटॉप माइक्रोस्कोप के समान नेटवर्क पर रहता है और इस प्रकार, माइक्रोस्कोप के लिए वर्चुअल सपोर्ट पीसी के रूप में कार्य करता है। वर्चुअल सपोर्ट पीसी से, उपयोगकर्ता टीमव्यूअर के माध्यम से माइक्रोस्कोप से जुड़ता है जो टीयूआई और टोमो चलाने वाले माइक्रोस्कोप पीसी तक सीधी पहुंच और नियंत्रण प्रदान करता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में दो भाग होते हैं (चरण 1 और चरण 2)। चरण 1 टोमो 5 (3 डी इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के लिए सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके रिमोट क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण पर केंद्रित है। एक (दूरस्थ) सत्र के लिए वॉक-थ्रू तेजी से उच्च आवर्धन पर छवियों को कैप्चर करता है ताकि अंततः उपयोगकर्ता को टोमोग्राफिक डेटा संग्रह के लिए नमूना क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर को निर्देशित करने की अनुमति मिल सके। चित्रा 1 इस प्रक्रिया को सारांशित करता है। चरण 2 ईएमक्लैरिटी (उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी और सबटोमोग्राम औसत के लिए सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके क्रायो-ईटी एसटीए डेटा प्रोसेसिंग का विवरण देता है। चित्रा 9 इस प्रक्रिया को सारांशित करता है।
प्रोटोकॉल दूरस्थ दर्शकों के लिए अभिप्रेत है। यह व्यक्ति को माइक्रोस्कोप पर शारीरिक रूप से मानता है और नमूनों को लोड करने से प्रत्यक्ष संरेखण किया जाता है और कैमरा ट्यूनिंग का ख्याल रखा जाता है और संदर्भ अधिग्रहण प्राप्त होता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक ऑटोलोडर के साथ एक तीन-कंडेनसर लेंस सिस्टम माना जाता है। टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर पर अधिक विस्तृत दिशानिर्देशों के लिए, निर्माता द्वारा एक विस्तृत मैनुअल विंडोज स्टार्ट बटन में उपलब्ध है जहां से सॉफ़्टवेयर लोड किया गया था।
टोमो 5
टोमोग्राफी सॉफ़्टवेयर का वर्कफ़्लो विवरण (दूरस्थ) बैच टोमोग्राफी सत्र सेटअप के लिए एक संभावित और सबसे सुव्यवस्थित तरीके पर प्रकाश डालता है। जबकि सॉफ्टवेयर शुरुआती लोगों के लिए आसान है, कुछ प्रारंभिक क्रायो-ईएम अनुभव और बुनियादी टोमोग्राफी समझ सेटअप के साथ मदद कर सकती है। महत्वपूर्ण चरणों को प्रोटोकॉल में हाइलाइट किया गया है और समस्या निवारण में मदद करनी चाहिए, भले ही एक अलग सेटअप दृष्टिकोण का उपयोग किया गया हो। सॉफ्टवेयर की उन्नति (दूरस्थ) डेटा संग्रह को आसान बनाएगी और क्रायो-ईटी को व्यापक उपयोगकर्ता आधार के लिए अधिक सुलभ बनाएगी। कुछ युक्तियाँ और चालें जो आमतौर पर सामना की जाने वाली समस्याओं के निवारण में मदद कर सकती हैं, नीचे वर्णित हैं।
चर्चा करने के लिए एक महत्वपूर्ण बिंदु ग्रिड की पसंद है क्योंकि, नमूने को ±60 ° तक झुकाते समय, उच्च झुकाव पर ग्रिड बार दृश्य (चित्रा 8) को अस्पष्ट कर सकते हैं। एक टीईएम ग्रिड पर, जाल का आकार ग्रिड की प्रति यूनिट लंबाई ग्रिड वर्गों की संख्या को संदर्भित करता है। बड़ी जाल संख्याओं में प्रति यूनिट लंबाई में अधिक ग्रिड वर्ग होते हैं, ग्रिड वर्गों का उच्च घनत्व होता है, और छोटे ग्रिड वर्ग होते हैं, अर्थात, 400-मेष ग्रिड में 200-मेष ग्रिड की तुलना में छोटे वर्ग होते हैं। टोमोग्राफी के लिए ग्रिड का एक अच्छा विकल्प 200-मेष या 300-मेष ग्रिड है। जैसा कि चित्रा 8 में दिखाया गया है, ग्रिड झुका हुआ है के रूप में इकट्ठा करने के लिए उपलब्ध क्षेत्र कम हो जाता है। ±60 ° झुकाव पर, 300-मेष ग्रिड में देखने का एक छोटा सा क्षेत्र होगा जिस पर एक पूर्ण टोमोग्राम प्राप्त किया जा सकता है। 200-मेष ग्रिड के फायदे यह हैं कि बड़े ग्रिड वर्ग आणविक टोमोग्राफी सेटअप को तेजी से बनाते हैं, और बढ़े हुए ग्रिड-स्क्वायर क्षेत्र के साथ, एक वर्ग संभवतः रातोंरात संग्रह के लिए पर्याप्त होगा। नुकसान यह है कि 200-मेष ग्रिड अधिक नाजुक होते हैं, इसलिए हैंडलिंग और क्लिपिंग के लिए अधिक चालाकी की आवश्यकता होती है।
इसके अलावा, यदि ईएम ग्रिड पर होली सपोर्ट फिल्म ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करते हुए, एक्सपोजर क्षेत्र के संबंध में फोकस और ट्रैकिंग क्षेत्र के सेटअप के लिए छेद रिक्ति पर विचार किया जाना चाहिए। आदर्श रूप से, वांछित आवर्धन पर बीम व्यास इष्टतम और तेज़ सेटअप के लिए झुकाव अक्ष के साथ एक्सपोजर क्षेत्र से सटे कार्बन क्षेत्र को कवर करने के लिए काफी छोटा होना चाहिए। इस तरह, प्रत्येक छेद में रुचि के संभावित क्षेत्रों का अधिग्रहण किया जा सकता है।
चूंकि सॉफ़्टवेयर की यूसेंट्रिक ऊंचाई दिनचर्या वर्तमान में उतनी मजबूत नहीं है, जैसे कि सीरियलईएम रूटीन, निम्नलिखित युक्तियां उस समस्या के आसपास काम कर सकती हैं। यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई निर्धारण यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट का उपयोग करने में विफल रहता है, तो कोई इसके बजाय अवलोकन प्रीसेट का उपयोग कर सकता है और “स्टेज झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक” को फिर से चला सकता है; यह मुद्दों को हल कर सकता है यदि यूसेंट्रिक ऊंचाई 0 से बहुत दूर है। यदि यह सफल होता है, तो परिशुद्धता में सुधार के लिए “यूसेंट्रिक हाइट” प्रीसेट के साथ “स्टेज टिल्ट द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक” को फिर से चलाया जा सकता है। यदि यह विफल रहता है, तो कोई यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट के साथ “बीम झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक” चला सकता है और फिर “स्टेज झुकाव द्वारा ऑटो-यूसेंट्रिक” को फिर से चला सकता है या मैन्युअल रूप से “स्टेज” सेटिंग्स के तहत टीईएम यूजर इंटरफेस में “ऑटो-यूसेंट्रिक बाय बीम टिल्ट” द्वारा समेकित जेड-ऊंचाई सेट कर सकता है। यदि छेद के दोहराए जाने वाले पैटर्न वाले ग्रिड का उपयोग किया जाता है, तो वे एक एकल क्रॉस-सहसंबंध शिखर की पहचान को रोक सकते हैं। छेद पैटर्न से क्रॉस-सहसंबंध को कम करने के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट को कम डिफोकस ऑफसेट जैसे -25 μm और / या कम एक्सपोज़र समय में बदलने की कोशिश कर सकते हैं। दूसरी ओर, लेसी ग्रिड / लैमेला का उपयोग करना एक मजबूत क्रॉस-सहसंबंध शिखर के लिए पर्याप्त संकेत प्रदान नहीं कर सकता है। क्रॉस-सहसंबंध शिखर को बढ़ाने के लिए यूसेंट्रिक ऊंचाई प्रीसेट को अधिक डिफोकस ऑफसेट जैसे -75 μm और / या विस्तारित एक्सपोज़र समय में बदलने की कोशिश कर सकते हैं। एक अन्य विकल्प छवि फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करना है; वे “तैयारी” टैब में पाए जा सकते हैं। फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करने के विकल्प प्रत्येक पूर्व निर्धारित के लिए इष्टतम क्रॉस-सहसंबंध शिखर खोजने के लिए कम (अवलोकन / ग्रिडस्क्वायर), मध्यम (यूसेंट्रिक ऊंचाई), और उच्च आवर्धन (ट्रैकिंग / फोकस) के लिए सेट किए जा सकते हैं। आवश्यक इनपुट एक छवि है, अर्थात्, 0 ° पर और 5 ° पर एक, इसके बाद दोनों छवियों की तुलना करने के लिए तुलना करें पर क्लिक करें। सबसे लंबे तरंग दैर्ध्य के लिए अनुशंसित प्रारंभिक मूल्य छवि में स्केल बार का एक-चौथाई है और सबसे कम तरंग दैर्ध्य के लिए स्केल बार का एक-चालीसवां हिस्सा है। यदि चोटी को मजबूती से पहचाना नहीं जाता है, तो कोई भी सेटिंग्स को अनुकूलित कर सकता है जब तक कि एक ठोस चोटी नहीं मिल जाती। हर बार छवियों को फिर से प्राप्त करने की आवश्यकता नहीं है; बस “तुलना करें” दबाना पर्याप्त है। यदि टीओएमओ अभी भी स्वचालित रूप से यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने में विफल रहता है, तो मैनुअल यूसेंट्रिक ऊंचाई अंशांकन का उपयोग किया जा सकता है। किसी को “तैयारी” टैब में अवलोकन आवर्धन में यथोचित बड़े बर्फ क्रिस्टल पर केंद्रित होना चाहिए, फिर टीईएम यूजर इंटरफेस के “स्टेज कंट्रोल” पर जाना चाहिए, अल्फा को -30 ° पर सेट करना चाहिए, और फ्लोरोसेंट स्क्रीन छवि का उपयोग करके क्रिस्टल को फिर से केंद्रित करने के लिए चरण जेड-वैल्यू को समायोजित करना चाहिए। टीईएम यूजर इंटरफेस में “उच्च रिज़ॉल्यूशन” और “उच्च कंट्रास्ट” सेटिंग्स का चयन करना इसे सरल बना देगा (फ्लोरोसेंट स्क्रीन विंडो के नीचे बटन)। वैकल्पिक रूप से, यदि लाइव मोड के साथ कैमरे तक पहुंच है, तो इसका उपयोग यूसेंट्रिक ऊंचाई निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है; यह फ्लोरोसेंट स्क्रीन की तुलना में आसान होगा।
5.8 से पहले टोमो 5 संस्करणों में सबसे बड़ी सीमाएं लापता मध्यम आवर्धन असेंबल, लापता खुराक सममित योजना और यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने से संबंधित समस्याएं हैं। ये सीरियलईएम में मौजूद हैं, तेजी से विकास और सामुदायिक समर्थन के साथ एक फ्रीवेयर, एक मजबूत यूसेंट्रिक ऊंचाई दिनचर्या, और स्क्रिप्ट का विकल्प, यानी, एक कस्टम-निर्मित खुराक सममित योजना। टोमो 5 में संस्करण 5.8 के बाद से, यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने के लिए सबसे अधिक सामना की जाने वाली समस्या, यानी, लक्ष्य जेड-वैल्यू के चारों ओर एक असफल लूपिंग, एक यूसेंट्रिक ऊंचाई स्वीकृति मानदंड सेट करने के विकल्प को लागू करके हल किया गया है। हालांकि, विभिन्न ग्रिड और नमूना प्रकारों के साथ, व्यक्तिगत सत्रों की अद्वितीय इमेजिंग स्थितियों को प्रतिबिंबित करने के लिए छवि फ़िल्टर सेटिंग्स को समायोजित करने और यूसेंट्रिक ऊंचाई खोजने के लिए सर्वोत्तम संभव क्रॉस-सहसंबंध चोटी देने और टोमोग्राम अधिग्रहण के दौरान मज़बूती से काम करने के लिए फोकस और ट्रैकिंग क्षेत्र के लिए अत्यधिक अनुशंसा की जाती है।
कुल मिलाकर, कई सुविधाएं महामारी के दौरान रिमोट ऑपरेशन के लिए तेजी से अनुकूलित हुई हैं। टोमो 5 सॉफ्टवेयर टोमोग्राफी के लिए एक आसान पहुंच और उपयोगकर्ता के अनुकूल मार्ग प्रदान करता है जो रिमोट ऑपरेशन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। सॉफ़्टवेयर में की गई प्रगति निस्संदेह समुदाय में सामान्य रूप से दूरस्थ डेटा संग्रह और टोमोग्राफी संग्रह को अधिक मुख्यधारा बनाना जारी रखेगी।
स्पष्टता
चूंकि एमक्लैरिटी टेम्पलेट-आधारित कण पिकिंग विधि का उपयोग करता है, इसलिए इसे ब्याज की वस्तु के लिए एक टेम्पलेट की आवश्यकता होती है। कण उठा (चरण 2.6) बहुत संवेदनशील और अंतिम संरचना की कुंजी है। औसत और संरेखण (चरण 2.9) से पहले, किसी को ध्यान से जांचना और मैन्युअल रूप से झूठी सकारात्मकता को हटाना सुनिश्चित करना चाहिए। जब कोई टेम्पलेट उपलब्ध नहीं होता है, तो ईएमक्लैरिटी का उपयोग करना आसान नहीं हो सकता है, लेकिन प्रारंभिक मॉडल बनाने के लिए अन्य सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना संभव है, उदाहरण के लिए, डायनेमो37 और पीईईटी48।
विषम नमूनों के लिए, ईएमक्लैरिटी एक वर्गीकरण विधि से लैस है जो उपयोगकर्ताओं को विभिन्न पैमानों के साथ विशिष्ट सुविधाओं पर ध्यान केंद्रित करने में सक्षम बनाता है। वर्गीकरण से पहले संरेखण के कुछ चक्रों को चलाना और इसे उच्च बिनिंग (जैसे बिन 4 या बिन 3) पर चलाना सहायक होता है।
सॉफ़्टवेयर के अप-टू-डेट संस्करण (V1.5.3.11) में पहले रिलीज़ (V1.0)17 की तुलना में महत्वपूर्ण अपडेट हैं। इनमें सीटीएफ अनुमान (चरण 2.3) के दौरान एक हैंडनेस चेक शामिल है, लेकिन इन तक सीमित नहीं है; संरेखण के लिए समरूपता (सीएक्स, आई, आई 2, ओ); प्रति-कण 3 डी नमूनाकरण कार्यों (3 डीएसएफ) की गणना; संगतता और स्थिरता के लिए मैटलैब 2019 ए पर स्विच; और कच्चे प्रक्षेपण छवियों (सीआईएसटीईएम) का उपयोग करके पुनर्निर्माण। सॉफ़्टवेयर विभिन्न नमूनों के लिए सुधार करना जारी रखेगा, और नवीनतम घोषणाएं ऑनलाइन पाई जा सकती हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
The authors have nothing to disclose.
हम वेलकम ट्रस्ट, एमआरसी और बीबीआरएससी द्वारा वित्त पोषित यूके के राष्ट्रीय इलेक्ट्रॉन बायो-इमेजिंग सेंटर (ईबीआईसी) में क्रायो-ईएम सुविधाओं तक पहुंच और समर्थन के लिए डायमंड लाइट सोर्स को स्वीकार करते हैं। हम एपोफेरिटिन टोमोग्राम (मूवी 1) के अधिग्रहण के लिए एंड्रयू होवे, न्यूरॉन टोमोग्राम (मूवी 2) की तैयारी और अधिग्रहण के लिए इशिका कुमार और साइनोबैक्टीरिया लैमेला-टोमोग्राम (मूवी 3) के लिए क्रेग मैकग्रेगर-चैटविन को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Software | |||
Tomography | Thermo Fisher Scientific | 5.9.0 | Internal terminology: Tomo5 in document |
TEM server | Thermo Fisher Scientific | 7.10.1 | |
TIA | Thermo Fisher Scientific | 5.10.1 | |
DigitalMicrograph | Gatan | 3.44 | |
emClarity | Open-Source software | 1.5.3.11 | Software for high-resolution cryo-electron tomography and subtomogram averaging |
IMOD | Open-Source software | 4.11 | Modeling, display and image processing programs used for 3D reconstruction and modeling of microscopy images with a special emphasis on electron microscopy data |
MotionCor2 | Free for academic use | 1.1.0 | A multi-GPU program that corrects beam-induced sample motion recorded on dose fractionated movie stacks |
ETomo | Open-Source software | 4.11 | ETomo is an interface for running a subset of IMOD and PEET commands. |
NoMachine | NoMachine, freeware | 7.9.2 | Remote desktop software |
TeamViewer | TeamViewer AG | – | Remote access and remote control computer software |
Materials | |||
Quantifoil (holey support film) EM grids | Quantifoil | – | A flat film of carbon with pre-defined hole size, shape and arrangement |
Instrumentation | |||
Titan Krios microscope | Thermo Fisher Scientific | Titan Krios G2 | |
K3 camera and GIB energy filter | Gatan | – | |
Falcon 4 camera and Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | – | |
Website | |||
Website 1: https://github.com/bHimes/emClarity/ | – | – | Link to download the emClarity software package |
Website 2: https://bio3d.colorado.edu/imod/ | – | – | Link to download IMOD |
Website 3: https://github.com/ffyr2w/emClarity-tutorial | – | – | Link to the emClarity online tutorial |
Website 4: https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software | – | – | Link to download MotionCor2 |
Website 5: https://github-wiki-see.page/m/bHimes/emClarity/wiki | – | – | Link to the newest announcements including updates and bug fixs for emClarity |