Zeitaufgelöste In vivo Messung der Neuropeptiddynamik mittels kapazitiver Immunsonde im Schweineherzen
Summary
Etablierte immunchemische Methoden zur Messung von Peptidtransmittern in vivo beruhen auf Mikrodialyse oder Bulk-Fluid-Draw, um die Probe für die Offline-Analyse zu erhalten. Diese leiden jedoch unter raumzeitlichen Einschränkungen. Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und Anwendung eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors, der die Grenzen der bestehenden Techniken überwindet.
Abstract
Die Fähigkeit, Biomarker in vivo zu messen, die für die Beurteilung des Krankheitsverlaufs relevant sind, ist für die wissenschaftliche und medizinische Gemeinschaft von großem Interesse. Die Auflösung der Ergebnisse, die mit den derzeitigen Methoden zur Messung bestimmter Biomarker erzielt werden, kann mehrere Tage oder Wochen dauern, da sie sowohl räumlich als auch zeitlich in ihrer Auflösung begrenzt sein können (z. B. Flüssigkeitskompartimentmikrodialyse der interstitiellen Flüssigkeit, die durch enzymgebundenen Immunsorbensassay [ELISA], Hochleistungsflüssigkeitschromatographie [HPLC] oder Massenspektrometrie analysiert wird); Daher ist ihre Anleitung zur rechtzeitigen Diagnose und Behandlung gestört. In der vorliegenden Studie wird über eine einzigartige Technik zum Nachweis und zur Messung von Peptidtransmittern in vivo durch den Einsatz eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors (CI-Sonde) berichtet. Das Herstellungsprotokoll und die In-vitro-Charakterisierung dieser Sonden werden beschrieben. Es werden Messungen der sympathischen Stimulations-evozierten Neuropeptid-Y-Freisetzung (NPY) in vivo durchgeführt. Die NPY-Freisetzung korreliert mit der sympathischen Freisetzung von Noradrenalin als Referenz. Die Daten zeigen einen Ansatz zur schnellen und lokalisierten Messung von Neuropeptiden in vivo. Zukünftige Anwendungen umfassen die intraoperative Echtzeitbewertung des Krankheitsverlaufs und den minimalinvasiven katheterbasierten Einsatz dieser Sonden.
Introduction
Mehrere chemische Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung von Biomarkern werden routinemäßig sowohl in der Proteinchemie als auch in der klinischen Diagnostik eingesetzt, insbesondere bei der Krebsdiagnose und der Beurteilung des Fortschreitens von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Derzeit beruhen Methoden wie die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), der enzymgebundene Immunsorbentien-Assay (ELISA) und die Massenspektrometrie auf der Probenentnahme aus dem Gefäßkompartiment 1,2,3 durch Bulk-Flüssigkeitsentnahme oder dem interstitiellen Kompartiment durch Mikrodialyse. Die Mikrodialyse verwendet einen semipermeablen Membranschlauch bekannter Länge, der in einer Region von Interesse platziert wird. Die Sammelflüssigkeit wird über mehrere Minuten4 durch das Röhrchen geleitet, um die Probe für die Analyse5 zu sammeln, wodurch die zeitliche Auflösung begrenzt wird. Auf diese Weise liefern die entnommenen Proben nur einen gemittelten Wert über die Zeit der lokalen Mikroumgebung und sind durch die Perfusionsrate und die Sammlung eines ausreichenden Probenvolumens begrenzt. Darüber hinaus erfordern diese Methoden die Bündelung experimenteller Daten und die Mittelung von Signalen; Daher können sie die Variabilität zwischen den Subjekten nicht berücksichtigen. Wichtig ist, dass die Zeit zwischen der Probenentnahme und der anschließenden Offline-Analyse ein sofortiges klinisches Eingreifen und Therapeutika ausschließt.
Im vorliegenden Protokoll wird die Verwendung eines kapazitiven Immunsonden-Biosensors (CI-Sonde) zur zeitaufgelösten elektrischen Detektion spezifischer bioaktiver Peptide skizziert. Neuropeptid Y (NPY), das aus postganglionären sympathischen Neuronen freigesetzt wird, die das Gefäßsystem, das Endokard, die Kardiomyozyten und die intrakardialen Ganglien innervieren, ist ein wichtiger neuromodulatorischer Peptidtransmitter im Herz-Kreislauf-System 6,7,8,9. Die hier vorgestellte Methode wurde entwickelt, um NPY zu messen, und die experimentelle Machbarkeit wird in einem Schweineherzmodell demonstriert. Dieser Ansatz gilt jedoch für jedes bioaktive Peptid, für das ein selektiver Antikörper verfügbar ist10. Diese Methode beruht auf dem kapazitiven Übergang zwischen einer Platindrahtsonde und der leitfähigen Flüssigkeit an der funktionalisierten Spitze11,12. In dieser Anwendung wurde die Wechselwirkung durch einen Antikörper gegen das Zielneuropeptid (NPY) vermittelt, das an die Elektrodenspitze gebunden war und die leitfähige Flüssigkeitsumgebung anschloss. Diese Funktionalisierung wurde durch die galvanische Abscheidung von reaktivem Polydopamin auf die Spitze der Platindrahtsonde10,13 erreicht.
Wenn die antikörperfunktionalisierte Sonde in einer Region von Interesse in vivo platziert wird, führt die evozierte endogene NPY-Freisetzung zu einer Bindung an die einfangenden Antikörper auf der Sondenspitze, und die leitfähige Flüssigkeit an der Elektrodenoberfläche wird durch das NPY-Protein verdrängt. Lokale Veränderungen in der elektrischen Umgebung führen zur Verdrängung von hochbeweglichen, hochdielektrischen Flüssigkeiten mit einem unbeweglichen, statisch geladenen Molekül. Dies verändert die Elektroden-Fluid-Grenzfläche und damit ihre Kapazität, die als Änderung des Ladungsstroms als Reaktion auf ein Schritt-Funktions-Befehlspotential gemessen wird. Ein negatives “Reset”-Potential wird unmittelbar nach jedem einzelnen Messzyklus eingesetzt, um gebundenen NPY durch elektrostatische Wechselwirkung aus dem Antikörper abzustoßen und so die Antikörperbindungsstellen für nachfolgende Messrundenzu räumen 10. Dies ermöglicht effektiv die zeitaufgelöste Messung von NPY. Die einzigartige CI-Technik überwindet die oben beschriebenen Einschränkungen der mikrodialysebasierten immunchemischen Methoden, um dynamische Biomarkerspiegel aus einem einzigen Experiment ohne Datenpooling oder Signalmittelung über mehrere Experimente zu messen9 und liefert Daten in nahezu Echtzeit. Darüber hinaus bietet die Fähigkeit, diese Methode an jeden Biomarker von Interesse anzupassen, für den ein geeigneter Antikörper auf einer zeitaufgelösten und lokalisierten Skala existiert, einen großen technischen Fortschritt in der immunchemischen Messung zur Bewertung des Krankheitsverlaufs und zur Anleitung therapeutischer Interventionen.
Die Software zur Datenerfassung und -analyse wurde in IGOR Pro (einer vollständig interaktiven Softwareumgebung) speziell geschrieben. Ein Analog-Digital-Wandlersystem (A/D) gab eine Befehlsspannung unter Computersteuerung aus und erfasste Daten von einem benutzerdefinierten Verstärker. Der Verstärker besaß bestimmte einzigartige Eigenschaften. Dazu gehörte ein Rückkopplungswiderstand (umschaltbar) für jeden der vier Erfassungskanäle, so dass 1 MOhm oder 10 MOhm Rückkopplungsspannungsklemmschaltungen gewählt werden konnten, um die Variabilität der Elektrode zu integrieren. Eine Bühneneinheit mit einem einzigen Kopf und einer gegenseitigen Masse / Referenzschaltung für alle vier Erfassungskanäle wurde ebenfalls gebaut, um das Gerät in der Nähe der Truhe in einem einzigen physischen Modul zu platzieren. Eine 1 MOhm Feedback-Widerstandseinstellung wurde verwendet, um alle gemeldeten Daten zu sammeln.
Die Filter- und Verstärkungseinstellungen wurden vom Verstärker telegrafiert und in der Datendatei aufgezeichnet. Die Daten wurden mit 1 kHz über einen 2-poligen analogen Bessel-Filter gefiltert, der mit 10 kHz digitalisiert wurde. Durch die Potentialdifferenz zwischen der Sonde und der umgebenden leitfähigen Lösung entsteht eine kapazitive Helmholtz-Schicht an der Sondenspitze. Die Ligandenbindung an den Antikörper an der Sondenspitze führt zu einer veränderten lokalen Ladung und damit zu einer Änderung der Helmholtz-Kapazität. Diese Änderung der kapazitiven Komponente der Schaltung führt zu einer Verschiebung der Größenordnung der eingespeisten Ladung, die erforderlich ist, um die Sonde auf das Potential im Stufenfunktionsspannungsprotokoll zu bringen. Somit führt die Bindung eines bestimmten Liganden an die funktionalisierte Sonde zu einer Veränderung der Elektrodenkapazitätsmessung als Änderung des kapazitiven Spitzenstroms.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung und Prüfung einer kapazitiven Immunsonde (CI-Sonde), die in der Lage ist, Biomarker von Interesse sowohl in vitro- als auch in vivo-Umgebungen nachzuweisen und zu messen. Die Detektion erfolgt durch Einfangen des Biomarkers an der Elektrodenspitze. Das Trapping-Ereignis verändert die kapazitive Verbindung zwischen einer kapazitiven Platindraht-Immunsonde und der umgebenden leitfähigen Flüssigkeitsumgebung, gemessen als Änderung des Ladungsstroms …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) für die fachkundige Unterstützung der In-vivo-Experimente . Diese Arbeit wurde vom NIH U01 EB025138 (JLA, CS) unterstützt.
Materials
| AgCl disc electrode | Warner Instruments (Holliston, MA) | 64-1307 | |
| Anti-NPY monoclonal antibody | Abcam, (Cambridge, MA) | ab112473 | |
| Custom multichannel amplifier/ 1 MΩ feedback resistor multichannel headstage | NPI Electronic, (Tamm, Germany) | NA | Based on NPI VA-10M multichannel amplifier |
| Dopamine HCl | Sigma Aldrich (St. Louis, MO) | H8502-10G | |
| Gold-plated male connector pin | AMP-TE Connectivity (Amplimite) | 6-66506-1 | |
| HEKA LIH 8+8 analog-to-digital/digital-to-analog device | HEKA Elektronik, (Holliston, MA) | NA | |
| Igor Pro data acquisition software, v. 7.08 | WaveMetrics, (Lake Oswego, OR) | Software driving command potential and data acquisition was custom written | |
| Masterflex L/S Standard Digital peristaltic pump | Cole Palmer, (Vernon Hills, IL) | ||
| PFA-coated platinum wire | A-M Systems, (Sequim, WA) | 773000 | 0.005” bare diameter, 0.008” coated diameter |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments (Sarasota, FL) | SYLG184 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 | |
| Synthetic porcine NPY peptide | Bachem (Torrance, CA) | 4011654 |
References
- Chow, S. L., et al. Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).
- Goldstein, D. S. Adrenal responses to stress. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).
- Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction. European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).
- Farrell, D. M., et al. Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).
- Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation. JCI Insight. 4 (23), 131648 (2019).
- Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone. Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).
- Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease. The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).
- Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y. JCI Insight. 5 (11), 135519 (2020).
- Rigel, D. F. Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT. American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).
- Kluge, N., et al. Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).
- Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. Capacitive biosensors. Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).
- Prodromidis, M. I. Impedimetric immunosensors-A review. Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318 (5849), 426-430 (2007).
- Leszczyszyn, D. J., et al. Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells. Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).
- Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells. Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).
- Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices. The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).
- Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).
- Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C). The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).
- Chan, S. A., et al. Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).
- Chow, R. H., von Rüden, L., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording, Second Edition. , 245-275 (1995).
- Ren, Y., et al. Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating. BMC Biotechnology. 11, 63 (2011).
