Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Udvikling af Drosophila melanogaster modeller til billeddannelse og optogenetisk kontrol af hjertefunktionen

Published: August 25, 2022 doi: 10.3791/63939
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering, Washington University in St. Louis

Summary

Den nuværende protokol beskriver dannelsen af Drosophila melanogaster , der udtrykker eNpHR2.0 eller ReaChR opsiner i hjertet til OCT-billeddannelse og optogenetisk hjertetempo. Detaljerede instruktioner til Drosophila OCT-billeddannelse og hjerteslagende modulering, herunder simulering af genoprettelig hjertestop, bradykardi og takykardi hos levende dyr på forskellige udviklingsstadier, rapporteres.

Abstract

Brug af Drosophila melanogaster (frugtflue) som modelorganisme har sikret betydelige fremskridt inden for mange områder af biologisk videnskab, fra cellulær organisation og genomiske undersøgelser til adfærdsstudier. På grund af den akkumulerede videnskabelige viden blev Drosophila i de senere år bragt til modellering af menneskelige sygdomme, herunder hjertesygdomme. Det præsenterede arbejde beskriver det eksperimentelle system til overvågning og manipulation af hjertefunktionen i forbindelse med en hel levende organisme ved hjælp af rødt lys (617 nm) og uden invasive procedurer. Kontrol over hjertet blev opnået ved hjælp af optogenetiske værktøjer. Optogenetik kombinerer ekspressionen af lysfølsomme transgene opsiner og deres optiske aktivering for at regulere det biologiske væv af interesse. I dette arbejde blev et brugerdefineret integreret optisk kohærenstomografi (OCT) billeddannelses- og optogenetisk stimuleringssystem brugt til at visualisere og modulere det fungerende D. melanogaster-hjerte på 3. instar larve- og tidlige puppeudviklingsstadier. UAS/GAL4 dobbeltgenetiske system blev anvendt til at udtrykke halorhodopsin (eNpHR2.0) og rødforskudt channelrhodopsin (ReaChR), specifikt i fluehjertet. Detaljer om forberedelse af D. melanogaster til live OCT-billeddannelse og optogenetisk pacing er angivet. En laboratorieudviklet integrationssoftware behandlede billeddata for at skabe visuelle præsentationer og kvantitative egenskaber ved Drosophila hjertefunktion. Resultaterne viser muligheden for at starte hjertestop og bradykardi forårsaget af eNpHR2.0-aktivering og udføre hjertetempo ved ReaChR-aktivering.

Introduction

I slutningen af 2010 valgte tidsskriftet Nature Methods optogenetik som Årets Metode1. Brug af genetiske værktøjer (transgene opsiner) reguleret af lys til at kontrollere biologiske væv af interesse med hidtil uset præcision og hastighed åbnede en oversvømmelsesport for nye applikationer. Til dato tilhører størstedelen af resultaterne neurovidenskab. Teknologien blev introduceret som en ny metode til præcis kontrol af enkeltneuroner2 og er avanceret til opdagelser inden for levende organismers kognitive funktioner3. Fra starten demonstrerede neurovidenskabere evnen til at modulere hele organismens adfærd. Ekspression og lysaktivering af ChR2 opsin hos mus dopaminerge neuroner forårsagede deres aktivering og var tilstrækkelige til at drive adfærdsmæssig konditionering4. Optogenetisk hæmning af en delmængde neuroner indeholdende halorhodopsin NpHR2.0 leveret til gnaverhjernens epileptiske fokus resulterede i dæmpning af elektroencefalografiske anfald5.

Optogenetiske anvendelser inden for kardiologi udvikler sig i et stabilt tempo6. ChR2 blev med succes udtrykt i kardiomyocytter cellekultur og hos mus; hjertetempo blev udført ved hjælp af blink af blåt lys (udført ved hjælp af en implanteret fiber i levende dyr)7. I zebrafisk blev ChR2 udtrykt og brugt til at identificere det temposkabende hjerteområde; NpHR-aktivering induceret hjertestop8. Optogenetisk hjertepacing har det unikke potentiale til at udvikle nye pacing- og resynkroniseringsterapier9. Forsøg på at etablere et autogent arytmi-termineringssystem er blevet rapporteret for nylig også10.

Omfattende forskning og udvikling af nye terapeutiske behandlinger kræver anvendelse af forskellige modelsystemer, fra cellekultur til pattedyr. Et hvirveldyrs hjerte er et meget komplekst organ. Kardiomyocytter (CM) udgør en tredjedel af alle hjerteceller; andre celler omfatter neuroner, vaskulære glatte muskelceller og ikke-excitable celler (dvs. endotelceller, fibroblaster og immunceller). Forskning i CM-cellekultur begrænser oversættelsen af de opnåede resultater til humanmedicinske anvendelser. Pattedyrsmodelorganismers genetiske manipulationer er begrænsede og tidskrævende. Mindre hvirvelløse modeller har mange fordele; deres kardiovaskulære system bærer alle de væsentlige histologiske elementer. Drosophila melanogaster (frugtflue) er et simpelt og kraftfuldt genetisk modelsystem til at undersøge rollen som gener forbundet med menneskelige sygdomme, herunder hjertesygdomme 11,12,13. Som kortlivede dyr repræsenterer bananfluer en glimrende mulighed for at modellere alders- eller sygdomsafhængige hjertefunktionsændringer, der kan spores gennem hele livet 14,15,16,17. Bananfluens hjerterør er placeret på den dorsale side af kroppen inden for 200 μm fra neglebåndets overflade, hvilket gør det muligt for synligt for nær-infrarødt lys at nå hjerterøret. Denne anatomiske funktion muliggør ikke-invasiv optisk pacing af Drosophila-hjertet ved hjælp af eksisterende optogenetiske værktøjer.

For at overvåge Drosophila-hjertet blev der udviklet et brugerdefineret spektral-domæne optisk kohærenstomografi (SD-OCT) billeddannelsessystem med et integreret LED-excitationsmodul med rødt lys18. Morfologiske og rytmiske ændringer i et relativt simpelt bananfluehjerte kan let analyseres med denne ikke-invasive biomedicinske billeddannelsesteknologi 12,19,20,21. Med forbedret optisk sektioneringsydelse og rumlig opløsning i mikronskala er OCT med succes blevet brugt til at undersøge strukturen og overvåge Drosophila-hjertets funktion på forskellige udviklingsstadier, herunder den 3. instar larve og tidlig puppe18. Dette system muliggør også samtidig overvågning og stimulering af Drosophilas hjertesygdom hos det intakte dyr. En skematisk oversigt over OCT-systemet er vist i figur 1. SD-OCT-systemet bruger en superluminescerende diode (SLD) som lyskilde (centerbølgelængde: 850 nm ± 10 nm, FWHM: 165 nm, se materialetabel). Ved hjælp af en 10x objektiv linse kan OCT-billeddannelsessystemet opnå en aksial opløsning på ~ 4,4 μm i luft og ~ 3,3 μm i væv og en lateral opløsning på ~ 2,8 μm, tilstrækkelig til at løse fine detaljer i flyvehjertestrukturerne18,22. Interferenssignaler fra reflekteret lys fra referencearmen og prøvearmen detekteres ved hjælp af et spektrometer med et 2048-pixel linjescanningskamera (maks. linjehastighed: 80 kHz, se Materialetabel). Den målte systemfølsomhed er ~ 95,1 dB. Hver OCT-scanning i B-tilstand genererer et tværsnitsbillede i xz-billedplanet. Gentagne B-mode billeder erhverves på samme sted for at skabe M-mode billeder, der fanger det bankende hjerte i over ~ 30 s 18,22,23. Billedhastigheden for M-mode billeddannelse er ~ 125 billeder / s, tilstrækkelig til at fange frugtfluehjertets bankende dynamik.

Til optogenetisk regulering af Drosophila hjertefunktion er et belysningsmodul med en 617 nm LED-lyskilde integreret med prøvearmen i SD-OCT-systemet. Stimuleringslyset er fokuseret på et sted med en diameter på ~ 2,2 mm på prøveoverfladen i samme position som billeddannelsens fokuspunkt. En brugerdefineret skriftlig software bruges til at styre belysningstilstanden (lysintensitet, pulsbredde og driftscyklus), justere lyspulsstimuleringsfrekvensen og synkronisere LED-modulbelysningen og M-tilstandOCT-billeddannelsesoptagelse 22.

Nylige publikationer beskrev Drosophila transgene system bestående af spatiotemporalt reguleret ChR2, ReaChR og eNpHR2.0 opsiner ved hjælp af UAS / GAL4 genetiske system. De opnåede resultater har vist evnen til at initiere hjertestop og bradykardi forårsaget af rødt lysaktivering af eNpHR2.0 og højere frekvens hjerte pacing forårsaget af blåt lys aktivering af ChR2. Lignende pacing eksperimenter blev udført med en anden channelrhodopsin, ReaChR, inducerbar ved rødt lys belysning 22,23,24. Opsinekspressionen i alle de beskrevne eksperimenter blev drevet af 24B-GAL4, hvor opsinekspression blev observeret i en bred vifte af væv, herunder kardiomyocytter og omgivende muskelceller. I den aktuelle undersøgelse blev 24B-GAL4 erstattet af en Hand-GAL4-driver for at opnå hjertespecifik eNpHR2.0 og ReaChR opsins udtryk.

Samlet set viser de præsenterede eksperimentelle resultater genoprettelig hjertestop og inducerbar bradykardi og takykardi hjertesygdomme. En detaljeret protokol med trinvise instruktioner om oprettelse af transgene Drosophila-modeller og udførelse af samtidig OCT-billeddannelse og optogenetiske pacing-eksperimenter i levende dyr leveres.

Protocol

For denne undersøgelse, eNpHR2.0 transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, ReaChR transgen linje w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO og hjertespecifik GAL4-driver indeholdende håndgenregulerende fragment w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (dette driverlager vil blive angivet som Hand-GAL4) blev brugt. y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 blev brugt som GFP-reporterlinje. De nævnte Drosophila-lagre blev hentet fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, se Materialetabel) og opretholdt ved stuetemperatur eller ved 18 °C på standard majsmelmedier. Drosophila-modellerne , der er udviklet i denne undersøgelse, er tilgængelige efter anmodning om samarbejde.

1. Drosophila genetiske kryds og medieforberedelse

  1. Skift 3. kromosombalancer TM3 Sb[1] til TM6 Sb Tb,hvilket skaber w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Se supplerende figur 1 for krydsningsordningen. Sæt kryds i hætteglas med almindelige majsmelmedier.
    BEMÆRK: Tilstedeværelsen af en Tb-markør giver brugerne mulighed for at skelne larver og pupper, der indeholder opsintransgen og GAL4-driveren, fra dyr, der indeholder opsin, men ingen driver25.
  2. Opbevar de genetiske krydsninger i en 25 °C, 70% fugtighedsinkubator på specielt formulerede all-trans retinaI (ATR)-holdige medier (se Materialetabel) i mørke i 5 dage til larveropsamling og 6 dage til puppeopsamling.
  3. Kombiner fem Hand-GAL4 /TM6 Sb Tb jomfruhunner og to til tre hanner fra UAS-opsin-bestande (eNpHR2.0 eller ReaChR) pr. hætteglas. Se krydsdiagrammet for eNpHR2.0 og ReaChR opsin i henholdsvis figur 2A og figur 2B.
  4. Den næste dag skal du forberede ATR-holdige mediehætteglas.
    1. Forbered semi-defineret mad i henhold til instruktionerne i BDSC26. I stedet for saccharose og glucose tilsættes kun saccharose (5,14 g/100 ml). Afkøles til ~60 °C under konstant omrøring.
    2. Forbered smalle fluehætteglas, og tilsæt 50 μL 100 mM ATR-ethanolopløsning til hvert hætteglas.
    3. Brug en serologisk pipette til at bortskaffe fluefoder til smalle fluehætteglas, 5 ml pr. hætteglas. Vortex ved maksimal hastighed i 10 s.
    4. Sæt hætteglassene i, og pakk dem ind i det mørke stof for at beskytte dem mod lys. Lad hætteglas tørre i mindst 12 timer (natten over).
  5. Den næste dag overføres fluerne støt æglæggende fra trin 1.3. hætteglassene med ATR-holdige fødevarer (trin 1.4.4). Beskyt stativerne med hætteglas mod lys.
  6. Efter 24-48 timer (afhængigt af antallet af æg, der er lagt), kasseres forældrene for at forhindre overpopulation af hætteglas.
  7. Saml ikke-Tb afkom og brug dem til hjertebilleddannelse.
    BEMÆRK: De fænotypiske forskelle på larve- og puppestadierne er vist i figur 2C. Resuméet og den omtrentlige tidslinje for prøveforberedelsestrinnene er vist i figur 3.

2. Optogenetisk kontrol af Drosophila-hjertet

  1. UAS-opsin/Hand-GAL4 larve/puppe fra hætteglasset (trin 1.7.), læg væv på, og tør forsigtigt mediet af kropsoverfladen med en malerpensel.
  2. Forbered mikroskopglasset og læg et lille stykke dobbeltsidet tape i midten.
  3. Brug en børste eller en fin pincet til forsigtigt at placere larven/puppen på båndoverfladen med rygsiden opad og vinkelret på rutsjebanens langside. Påfør et blidt tryk for at fastgøre larven/puppen til båndoverfladen.
  4. Sæt diaset op på billedstadiet med larve/puppe nedad.
  5. Tænd OCT-lyskilden ved hjælp af laserstyringssoftware (se Materialetabel). Åbn den brugerdefinerede SD-OCT-kontrolsoftware, og klik derefter på Eksempel vindue.
  6. Indstil scanningsparametrene i SD-OCT-softwaren.
    BEMÆRK: Målet er at justere prøven for optimal billeddannelse af det bankende hjerte, så valg af X-området og Y-området dækker hjertets region. På dette trin er både antallet af A-scanninger og B-scanninger 400. Området i x- og y-retningerne er ~ 490 μm og ~ 537 μm, der viser hjertets to ortogonale tværsnit (henholdsvis xz og yz).
  7. Brug mikromanipulatorer til at kontrollere prøvestadiet for at bringe fluehjertet i fokus. Juster brændvidden for at minimere lysrefleksion fra fluens neglebåndsoverflade. Overvej at anvende mineralolie på larvens/puppens overflade for at minimere refleksionen.
    BEMÆRK: Olie kan øge risikoen for dyrebevægelser ved at kompromittere tapeklæbeegenskaberne.
  8. Sørg for, at fluehjertet kan ses fuldt ud i billedvinduet uden forvrængninger, blokeres af væv og ikke-ubetydelige skygger og refleksioner; Ellers skal du gå tilbage til trin 2.7.
  9. Indstil scanningsparametrene for M-mode OCT-billedoptagelse.
    BEMÆRK: Antallet af A-scanninger reduceres i forhold til trin 2.7. for den hurtigere billedhastighed for at fange fluehjertets bankende dynamik (flere Hz). Antallet af B-scanninger angiver antallet af gentagne rammer til M-mode billeddannelse, som kan justeres baseret på optagetiden og den tilgængelige systemhukommelse. I dette eksperiment kan 128 A-scanninger tillade en hastighed på ~ 125 billeder / s, og 4.000 gentagne B-scanninger registreres, hvilket giver en kontinuerlig optagelse på ~ 32 s.
  10. Indskaf fem sæt kontroldata uden røde lysstimuleringsimpulser for at beregne hvilepulsen (RHR).
  11. Design lyspulsen til tempostimulering i den brugerdefinerede OCT-styringssoftware. I "Indstillinger" skal du tilføje de designede lyspulssekvenser for at kontrollere pulsfrekvens, pulsbredde, stimuleringsvarighed og ventetid i henhold til forskellige stimuleringsprotokoller.
    BEMÆRK: RHR måles fra kontroleksperimentet uden lysbelysning og bruges til at beregne den frekvens, hvormed lys skal pulseres til tachypacing- og bradypacing-eksperimenter22.
  12. Åbn lysstyringssoftwaren (se Materialetabel) for at generere røde lysimpulser. Vælg pulstilstand i "Valg af tilstand". Dobbeltklik på figuren for indstillingerne "Pulsprofil", og vælg Følgertilstand. Hold OFF-intensiteten som 0, og indstil ON-intensitetsprocenten ved beregning af den faktiske effekttæthed.
    BEMÆRK: Stimuleringslysimpulser udløses af et signal fra OCT-styringssoftwaren i henhold til indstillingerne i trin 2.12.
  13. Få M-mode videoer af det bankende Drosophila hjerte med lysstimulering ved at klikke på Indløs i OCT-kontrolsoftwaren. Gentag målingerne 5x.

3. Billedanalyse

  1. Åbn den specialudviklede fluehjertesegmenteringssoftware.
  2. Klik på Vælg fil, og vælg derefter den fil, der skal analyseres i den GUI, der vises.
  3. Indtast både de lodrette og vandrette grænser for hjerteområdet i pixel i de øverste tekstbokse. Klik på Ændre størrelse. Brug skyderen i bunden til at sikre, at hele hjerteområdet er synligt, og at det fylder hele kassen for hele samlingen. Hvis det ikke er tilfældet, skal du gentage denne proces og justere grænserne.
  4. Klik på Forudsig for at forudsige hjerteregionen. Programmet vil nu gennemgå hvert udsnit i samlingen og vælge hjerteregionen, hvilket tager cirka 3 minutter.
  5. Klik på HR Plot , når forudsigelsen er afsluttet. Dette åbner et nyt vindue, der viser et plot af hjerteområdet over tid. Sørg for, at de korrekte top- eller dalområder er valgt. Vælg Puls og derefter HR for at generere et endeligt tal, og funktionsparametrene gemmes i .csv-filerne samtidigt.

Representative Results

D. melanogasterdyr , der udtrykker røde lysfølsomme opsins eNpHR2.0 eller ReaChR i hjerterøret, blev genereret ved at opnå afkom fra krydset mellem hver UAS-opsin transgen linje og Hand-GAL4 driver . GAL4-driverens vævsspecificitet blev verificeret ved billeddannelse af GFP-ekspression (figur 4). Drosophila 3. instar larve og tidlige puppeudviklingsstadier blev brugt til at demonstrere virkningerne af eNpHR2.0 og ReaChR-aktivering ved rødt lys. Designede ~ 617 nm røde lysimpulser, leveret af LED, oplyste larven / puppen og aktiverede eNpHR2.0 og ReaChR i hjertet. Selvom den rapporterede maksimale responsbølgelængde for NpHR er ~ 580 nm og af ReaChR er ~ 600 nm, kan 617 nm lysbelysning trænge dybere ind med forbedret lysenergitilførsel mod det opsin-ekspressive hjertevæv22.

Monteret på mikroskopglasset med rygsiden nedad i den omvendte mikroskopopsætning blev larven/puppen oplyst af en LED-lysstråle rettet mod A7-kropssegmentet. Eksempler på kropstværsnitsbilleder er vist i figur 5A og figur 6A. Hjertet fremstår som en sammentrækkende og udvidende cirkulær form i videooptagelserne bestående af 4.000 billeder (Supplerende videoer 1-6). For at efterligne forskellige hjertesygdomme blev fire typer lysimpulser designet. En enkelt puls, der varede 10 s efter 5 sekunders ventetid, genererede genoprettelig hjertestop induceret af eNpHR2.0, som vist i figur 5B. For hjertet, der gik langsommere end hvilepulsen (RHR), medieret af eNpHR2.0, blev der anvendt to lyspulssekvenser med pacingfrekvenser svarende til RHR/2 og RHR/4, der varede 8 s med en ventetid på 6 s imellem (figur 5C). Arbejdscyklussen for hver lyspulssekvens var 90%. Dette lysstimuleringsregime forårsagede en hjertesygdom, der minder om bradykardi. Stimuleringsmønsteret for at øge hjertefrekvensen på grund af ReaChR-aktivering bestod af tre sekvenser af lysimpulser ved frekvenser af henholdsvis RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz med en pulsbredde på 20 ms (figur 5D). Dette pulsregime var rettet mod at forårsage en takykardisk hjertesygdom. Lyseffekttætheden var 7,49 mW/mm2 under alle eksperimenterne. Til kontroleksperimenter blev der ikke indstillet nogen lysbelysning.

Hver eksperimentel variant blev registreret fem gange. M-mode videoer af fluehjertet blev behandlet til 2D-masker ved hjælp af FlyNet 2.027. Denne software segmenterer automatisk hjerteregionen for at producere hjertefunktionsdatasættene. Programmet giver en maske af hjertet i hver ramme, som kan korrigeres yderligere manuelt, hvis det er nødvendigt, for at generere nøjagtig kvantificering af de funktionelle parametre for det bankende hjerte, såsom puls (HR), slutdiastolisk dimension (EDD) og slut-systolisk dimension (ESD), fraktioneret forkortelse (FR), endediastolisk område (EDA), slut-systolisk område (ESA) osv. Pulsen måles ved at analysere hjerteområdet over tid. Kontrolvideoen uden lysimpulser bruges til at etablere en baseline puls (f.eks. RHR) for hvert dyr.

Figur 5B og figur 6B viser 10 s lang hjertestop forårsaget af hånd>eNpHR2.0 aktivering ved hjælp af rødt lys (617 nm) i henholdsvis larve og puppe. Da det røde lys blev tændt, stoppede Drosophilas hjerte med at slå og forblev i denne tilstand indtil slutningen af lysbelysningen. Hjertefunktionen blev genoprettet, efter at det røde lys blev slukket. Dyr, der ikke havde udtrykt opsin ("ingen opsin"-kontrol), reagerede ikke på rødt lysbelysningen (supplerende figur 2A og supplerende figur 3A). Kontrolforsøgene med Hand>eNpHR2.0-dyr , hvor 10'erens røde lysbelysning ikke var tændt ("ingen lys" -kontrol), viste, at hjertet slog normalt (supplerende figur 4A og supplerende figur 4C).

Ved hjælp af Hand>eNpHR2.0-dyr blev røde lysimpulser ved frekvenser lavere end RHR påført. Hjertekontraktionsfrekvensen blev reduceret efter lyssignalerne; denne langsommere puls efterligner en type hjertearytmi, bradykardi (figur 5C og figur 6C for henholdsvis larve og puppe). Det langsommere hjertetempo blev ikke observeret i "no opsin" (supplerende figur 2B og supplerende figur 3B) og i "intet lys" (supplerende figur 4A og supplerende figur 4C) kontroleksperimenter.

Forøgelse af hjertefrekvensen kan opnås ved at aktivere Hand>ReaChR opsin med rødt lys pulstog med en frekvens højere end RHR for det givne dyr. En serie på tre lyspulstog ved forskellige stimuleringsfrekvenser (f.eks. RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz, RHR + 1,5 Hz) blev anvendt på Hand>ReaChR larver og puppehjerter. De opnåede data viser tydeligt øget puls efter lysimpulserne (figur 5D og figur 6D for henholdsvis larve og puppe). Hjertesygdommen demonstreret i disse eksperimenter efterligner takykardi. Negative kontroleksperimenter er vist i supplerende figur 2C, supplerende figur 3C og supplerende figur 4B,D.

Samlet set viser resultaterne gennemførligheden af ikke-invasiv og specifik optogenetisk kontrol af hjerterytmen på forskellige udviklingsstadier i transgene dyremodeller af D. melanogaster.

Figure 1
Figur 1: OCT billedbehandlingssystem integreret med 617 nm LED-modul til optogenetisk styring af Drosophila hjertefunktion.

Figure 2
Figur 2: Generering af D. melanogaster dyr, der udtrykker opsin i hjertet. (A) Genetisk krydsdiagram. Hunnerne Hand-GAL4/TM6 SbTb blev krydset til hanner med eNpHR2.0. Det resulterende Hand-GAL4/eNpHR2.0 afkom (markeret med den røde stjerne) blev indsamlet til OCT-billeddannelse, og Hand-GAL4/TM6 Sb Tb blev kasseret baseret på deres fænotypiske udseende. (B) Genetisk krydsdiagram. Hunnerne Hand-GAL4/TM6 SbTb blev krydset til hanner med ReaChR. Det resulterende Hand-GAL4/ReaChR-afkom (markeret med den røde stjerne) blev indsamlet til OCT-billeddannelse, og Hand-GAL4/TM6 Sb Tb blev kasseret baseret på deres fænotypiske udseende. (C) Fænotypiske forskelle mellem Hand-GAL4/opsin (rød stjerne) og Hand-GAL4/TM6 Tb afkom. Dyr, der bærer Tb-genmutationen på TM6-kromosomet, har en "tubby" kropsform sammenlignet med normal, ikke-Tb larve eller puppe. Det venstre panel viser larver; højre panel viser tidlige pupper. Billeder indeholder også en lineal med 1 mm mærker. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skematisk præsentation og tidslinje for billedbehandlingsprocedurerne. Forældrelagre opbevares i flueflasker; jomfruhunner og mænd krydses i smalle hætteglas fyldt med almindelig mad (angivet med gul farve). Aktivt æglæggende fluer overføres til ATR-holdige medier (vist i brune) hætteglas. Hætteglas med udviklende afkom skal opbevares i mørke fra dette trin. 3. instar larver og tidlige pupper opsamles fra hætteglasvæggene til billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: D. melanogaster tidlig puppe, der udtrykker UAS-GFP (BDSC 6658) drevet af Hand-GAL4 (BDSC 48396). Fluorescensmønsteret bekræfter hjertespecificiteten af Hand-GAL4-driveren . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Simulering af hjertestop, bradykardi og takykardi hos D. melanogaster larve. (A) OCT-billede af et larvekropstværsnit. Hjertet fremstår som en cirkel under kroppens overflade. (B) Grafisk præsentation af det genoprettelige hjertestop. Det øverste panel viser timingen (X-aksen) for rødlysbelysningen (Y-akse, lyskildens effektniveauprocent). Midterpanelet angiver ændringen i hjerteområdet (Y-akse, kvadratmikrometer) over tid (X-akse). Det nederste panel viser pulsændringen (Y-aksen, hertz) over tid (X-aksen). (C) Grafisk præsentation af eNpHR2.0-medieret genoprettelig bradykardi. Det øverste panel viser impulser af rødlysbelysningen, hvilket fremkalder to perioder med bradykardi: 50% af RHR og 25% af RHR. Hjerteområde og pulsændringer vises på henholdsvis det midterste og nederste panel. (D) Grafisk præsentation af hjertetempoet ved aktiveret ReaChR. Det øverste panel viser en række 20 ms røde lysimpulser, der forekommer ved RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjertekontraktionerne følger lyspulsfrekvenserne, som vist på de midterste og nederste paneler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Simulering af hjertestop, bradykardi og takykardi i D. melanogaster puppe. (A) OCT-billede af pupal kropstværsnit. Hjertet fremstår som en cirkel under kroppens overflade. (B) Grafisk præsentation af det genoprettelige hjertestop. Det øverste panel viser timingen (X-aksen) for rødlysbelysningen (Y-akse, lyskildens effektniveauprocent). Midterpanelet angiver ændringen i hjerteområdet (Y-akse, kvadratmikrometer) over tid (X-akse). Det nederste panel viser pulsændringen (Y-aksen, hertz) over tid (X-aksen). (C) Grafisk præsentation af eNpHR2.0-medieret genoprettelig bradykardi. Det øverste panel viser impulser af rødlysbelysningen, hvilket fremkalder to perioder med bradykardi: 50% af RHR og 25% af RHR. De midterste og nederste paneler viser henholdsvis hjerteområde og pulsændringer. (D) Grafisk præsentation af hjertetempoet ved aktiveret ReaChR. Det øverste panel viser en række 20 ms røde lysimpulser ved RHR + 0,5 Hz, RHR + 1 Hz og RHR + 1,5 Hz frekvenser. Hjertekontraktionerne følger frekvenserne af lyspulsen, som vist på de midterste og nederste paneler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Genetiske krydsninger til erstatning af TM3 Sb balancer kromosom med TM6 Sb Tb. Jomfru hunner Hand-GAL4 m+/ TM3 Sb blev krydset med nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts m+/ TM6 Sb Tb hanner. Hand-GAL4 m+/ TM6 Sb Tb afkom, herunder jomfruelige hunner og hanner, blev udvalgt (screening for pigmenterede øjne kombineret med tubby kropsform). Udvalgte fluer blev selvkrydset for at etablere en stabil bestand. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 2: I kontrolforsøg ændres vildtypelarvens hjerterytme ikke ved rød lysbelysning. (A) Der blev ikke observeret hjertestop under rødlysbelysningen hos wt larven. Det øverste panel viser hjertebillederne i M-tilstand. Den røde linje angiver belysningstimingen. De midterste og nederste paneler viser hjerteområdet og pulsen i løbet af 32 s billeddannelsestiden. (B,C) Røde lysimpulser ændrer ikke hjertefrekvensen i wt larve. De øverste paneler viser hjertebillederne i M-tilstand. Den røde linje angiver belysningstimingen. De midterste og nederste paneler viser hjerteområdet og pulsen i løbet af 32 s billeddannelsestiden. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 3: I kontrolforsøg ændres vildtypepuppens hjerterytme ikke ved rødt lysbelysning. (A) Der blev ikke observeret hjertestop under rødlysbelysningen hos wt larven. Det øverste panel viser hjertebillederne i M-tilstand. Den røde linje angiver belysningstimingen. De midterste og nederste paneler viser hjerteområdet og pulsen i løbet af 32 s billeddannelsestiden. (B,C) Røde lysimpulser ændrer ikke hjertefrekvensen i wt puppen. De øverste paneler viser hjertebillederne i M-tilstand. Den røde linje angiver belysningstimingen. De midterste og nederste paneler viser hjerteområdet og pulsen i løbet af 32 s billeddannelsestiden. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende figur 4: D. melanogasterlarver og pupper, der udtrykker Hand>eNpHR2.0 eller Hand>ReaChR , viser ikke signifikante HR-ændringer under OCT-billeddannelse uden rødt lysbelysning. (A) Pulsen hos hand>eNpHR2.0 larve. (B) Pulsen hos Hand>ReaChR larve. (C) Pulsen af Hand>eNpHR2.0 puppe. (D) Pulsen af Hand>ReaChR puppe. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende video 1: Aktiveret eNpHR2.0 forårsager hjertestop hos D. melanogaster larve. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 2: Aktiveret eNpHR2.0 forårsager hjertestop i D. melanogaster puppe. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 3: eNpHR2.0-medieret genoprettelig bradykardi i D. melanogaster larve. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 4: eNpHR2.0-medieret genoprettelig bradykardi i D. melanogaster puppe. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 5: Hjertepacing ved aktiveret ReaChR i D. melanogaster larve. Klik her for at downloade denne video.

Supplerende video 6: Hjertepacing ved aktiveret ReaChR i D. melanogaster puppe. Klik her for at downloade denne video.

Discussion

Sammenlignet med vores tidligere rapporter, hvor ekspressionen af opsiner blev drevet ikke kun i hjertet, men også i det omgivende muskelvæv, rapporterer det nuværende arbejde ved hjælp af en hjertespecifik driver, Hand-GAL4. Denne nye Hand> opsin genetiske konfiguration, der anvendes til optogenetisk hjerteregulering, bekræfter yderligere tidligere rapporterede resultater og etablerer en bedre Drosophila kardiovaskulær forskningsmodel.

Medieforberedelse er afgørende for eksperimenternes succes. Opsinproteiner kræver en ligand, all-trans retinal (ATR), for at fungere28. Fluer producerer ikke nok ATR, så ATR skal suppleres med fluemedierne. I denne undersøgelse blev den tidligere rapporterede instant food erstattet med semi-defined media29. Den nye opskrift på ATR-holdige medier blev introduceret for at sikre en ensartet fordeling af ATR. ATR er ikke opløselig i vand; når ethanolbaseret 100 mM ATR-lager tilsættes til vandbaserede medier, spredes det ved at hvirvel hætteglassene indeholdende varme semidefinerede medier. Den tidligere rapporterede ATR-koncentration blev også reduceret fra 10 mM for eNpHR2.0 og 3 mM for ReaChR22 til en slutkoncentration på 1 mM for begge. Denne koncentration er tilstrækkelig til at sikre korrekt eNpHR2.0 og ReaChR-funktion.

En vigtig del af den eksperimentelle succes er den forbedrede databehandling med FlyNet 2.027. Laboratoriet har fortsat med at udvikle denne software for at forbedre både beregningseffektiviteten og nøjagtigheden af den automatiserede fluehjertesegmenteringsalgoritme. Tværsnitsmaskerne produceret af denne software bruges til at udlede Drosophila fysiologiske data såsom fraktioneret forkortelse og hjertevægshastighed. Denne tilgang har muliggjort effektiv dataanalyse med minimal menneskelig overvågning, hvilket gør det hurtigere og mere pålideligt at karakterisere hjertefunktionen for store datasæt til billeddannelse af fluehjerte.

Myokardieinfarkt er fortsat den største dødsårsag, og myokardieiskæmi bidrager til to tredjedele af alle tilfælde af hjertesvigt, som hurtigt dukker op blandt de førende årsager til dødelighed og sygelighed i USA30. Udviklingen af nye terapeutiske og medicinske anordninger kræver dyb viden om mekanismerne for hjertesygdomme på fysiologiske og biokemiske niveauer. Disse mål kan opnås ved hjælp af modelorganismer. D. melanogaster har etableret sig som en af de mest pålidelige og effektive modeller 31,32,33,34,35. Dette arbejde har genereret de simulerede Drosophila hjertesygdomme modeller induceret af en ikke-invasiv optogenetisk tilgang. Udviklingen af ikke-invasive optiske hjerte pacing teknologier giver grundlag for at udvikle et alternativ til traditionelle elektriske hjerte pacing enheder. Brug af OCT til at observere hjertefunktionen i realtid gør det muligt for undersøgelser nøjagtigt at karakterisere relevant hjertefysiologi i Drosophila-modeller til avancerede undersøgelser, herunder screening af lægemiddelkandidater. OCT-billeddannelse har en penetrationsdybde på ~ 1 mm, hvilket fungerer godt for Drosophila-hjertestudier, men begrænser dets anvendelse til at karakterisere hjertefunktionen i større dyremodeller. Desuden er direkte oversættelse af Drosophila-forskning til pattedyrsmodeller en udfordring. Nye optogenetiske værktøjer skal udvikles for at forbedre opsinernes følsomhed og oversætte dem til forskellige modelsystemer, herunder zebrafisk, mus, rotter og menneskelige hjerteorganoider, til kardiovaskulær forskning.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker Andrey Komarov, Yuxuan Wang og Jiantao Zhu for deres hjælp til dataanalyse og takker Zhou-laboratoriemedlemmerne for deres værdifulde diskussioner. Arbejdet i Dr. Zhous laboratorium blev støttet af en opstartsfond fra Washington University i St. Louis, National Institutes of Health (NIH) tilskud R01-EB025209 og R01-HL156265 og Clayco Foundation Innovative Research Award.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
All-trans retinal Cayman Chemicals 18449
Bacto Peptone Gibco 02-10-2025
BioLED Light Source Control Module, 4-channel Migtex Systems BLS-SA04-US Part of the optogenetic stimulation module
Broadband Light Source Module Superlum cBLMD-T-850-HP Part of the SD-OCT imaging system
Cobra-S 800 OCT Spectrometers  Wasatch Photonics CS800-840/180-80-OC2K-U3 Part of the SD-OCT imaging system
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professtional 34155 tissues
Drosophila agar Genesee Scientific 66-103
Drosophila culture bottles Genesee Scientific 32-131
FlyNet 2.0 Software Z-Lab Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab
High-Power LED Collimator Sources Migtex Systems BLS-LCS-0617-03-22 Part of the optogenetic stimulation module
Inactive dry yeast Genesee Scientific 62-106
Microscope slides AmScope BS-72P
Narrow plugs for Drosophila culture Genesee Scientific 59-200
Narrow vials for Drosophila culture Genesee Scientific 32-116SB
Permanent double-sided tape Scotch
Plugs for Drosophila bottles Genesee Scientific 59-194
Propionic Acid Sigma P1386-1L
SD-OCT control software Z-Lab Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system Z-Lab Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)
Sucrose Carolina 89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 41752 eNpHR2.0 transgenic line
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 53748 ReaChR transgenic line
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 48396 Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock #6658 GFP reporter line
Yeast extract Lab Scientific bioKEMIX 978-907-4243

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1 (2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. The Genome of Drosophila melanogaster. , Elsevier. (1992).
  26. Bloomington Drosophila Stock Center. , Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022).
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56 (2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).

Tags

Bioengineering Udgave 186 Drosophila melanogaster OCT optogenetik hjertestop bradykardi takykardi hjerte pacing opsin eNpHR2.0 ReaChR
Udvikling af <em>Drosophila melanogaster</em> modeller til billeddannelse og optogenetisk kontrol af hjertefunktionen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gracheva, E., Wang, F., Matt, A.,… More

Gracheva, E., Wang, F., Matt, A., Liang, H., Fishman, M., Zhou, C. Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function. J. Vis. Exp. (186), e63939, doi:10.3791/63939 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter