網膜神経血管疾患研究のための ex vivo モデルとしての成体マウス網膜網膜の外植片
Summary
このプロトコルは、成体マウスから得られた網膜外植片の単離、解剖、培養、および染色の手順を提示し、説明しています。この方法は、糖尿病性網膜症などの異なる網膜神経血管疾患を研究するための ex vivo モデルとして有益である。
Abstract
網膜研究における課題の1つは、網膜ニューロン、グリア細胞、血管細胞などの異なる網膜細胞間のクロストークを研究することです。網膜ニューロンを in vitroで 単離、培養、維持することには、技術的および生物学的な限界があります。網膜外植片の培養は、これらの制限を克服し、血管系に依存しない生化学的パラメータが十分に制御されたさまざまな網膜細胞間のクロストークを研究するための独自の ex vivo モデルを提供する可能性があります。さらに、網膜外植片は、糖尿病性網膜症などのさまざまな網膜血管および神経変性疾患における新しい薬理学的介入を研究するための効果的なスクリーニングツールです。ここでは、網膜外植片の分離と長期間の培養のための詳細なプロトコルについて説明します。原稿はまた、網膜外植片培養の望ましい結果と再現性に影響を与える可能性のあるこの手順中の技術的な問題のいくつかを提示します。網膜血管、グリア細胞、およびニューロンの免疫染色は、網膜外植片培養の開始から2週間後に無傷の網膜毛細血管および神経膠細胞を示しました。これにより、糖尿病性網膜症などの網膜疾患を模倣する条件下での網膜血管系および神経膠細胞の変化を研究するための信頼できるツールとして網膜外植片が確立されます。
Introduction
網膜疾患を研究するために、in vivoモデルとin vitroモデルの両方を含むさまざまなモデルが提示されています。研究における動物の使用は、依然として継続的な倫理的およびトランスレーショナルな議論の問題です1。マウスまたはラットなどのげっ歯類を含む動物モデルは、網膜研究において一般的に使用される2、3、4。しかし、黄斑の欠如や色覚の違いなど、げっ歯類の網膜の生理学的機能が人間と比較して異なるため、臨床上の懸念が生じています5。網膜研究のための人間の死後眼の使用には、元のサンプルの遺伝的背景、ドナーの病歴、およびドナーの以前の環境またはライフスタイルの違いを含むがこれらに限定されない多くの問題もあります6。さらに、網膜研究におけるin vitroモデルの使用には、いくつかの欠点もあります。網膜疾患の研究に使用される細胞培養モデルには、ヒト由来の細胞株、初代細胞、または幹細胞の利用が含まれます7。使用した細胞培養モデルは、汚染、誤認、または脱分化の点で問題があることが示されています8、9、10、11。最近、網膜オルガノイド技術は大きな進歩を示しています。しかしながら、in vitroでの非常に複雑な網膜の構築にはいくつかの制限がある。例えば、網膜オルガノイドは、成熟したin vivo網膜と同じ生理学的および生化学的特徴を有しない。この制限を克服するために、網膜オルガノイド技術は、平滑筋細胞、血管系、およびミクログリア12、13、14、15のような免疫細胞を含む、より多くの生物学的および細胞的特徴を統合する必要があります。
有機型網膜外植片は、糖尿病性網膜症および変性網膜疾患などの網膜疾患を研究するための信頼できるツールとして浮上している16,17,18,19。他の既存の技術と比較して、網膜外植片の使用は、同じ生化学的パラメータの下で全身変数とは無関係に様々な網膜細胞間のクロストークを研究する独自の機能を追加することによって、in vitro網膜細胞培養と現在のin vivo動物モデルの両方をサポートします。外植片培養により、異なる網膜細胞を同じ環境に一緒に保持することができ、網膜細胞間相互作用の保存が可能になります20、21、22。さらに、以前の研究では、網膜外植片が培養網膜細胞の形態学的構造と機能を維持できることが示されました23。したがって、網膜外植片は、多種多様な網膜疾患の可能な治療標的を調査するための適切なプラットフォームを提供することができる24、25、26。網膜外植片培養は、制御可能な技術を提供し、多数の薬理学的操作を可能にし、いくつかの分子メカニズムを明らかにすることができる既存のモトッドの非常に柔軟な代替品です27。
この論文の全体的な目標は、網膜外植片技術をin vitro 細胞培養と in vivo 動物モデルの間の合理的な中間モデルシステムとして提示することです。この技術は、解離した細胞よりも優れた方法で網膜機能を模倣することができます。さまざまな網膜層が無傷のままであるため、網膜細胞間相互作用は、十分に制御された生化学的条件下で、血管系の機能とは無関係に実験室で評価できます28。
Protocol
すべての動物実験は、米国ミシガン州ロチェスターのオークランド大学の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)の声明によって確立されたガイドラインに従いました。 1.動物の準備 動物を光制御された環境で一定の温度下に保管してください。動物飼育室の温度設?…
Representative Results
網膜外植体の神経細胞および血管網膜細胞の培養培地ex vivoでの長時間の生存 私たちのプロトコルを利用して網膜外植片を培養することにより、最大2週間生存可能なさまざまな網膜細胞を維持することに成功しました。異なる網膜細胞の存在を確認するために、神経細胞マーカー(NeuN)、グリア細胞マーカー(GFAP)、および血管マーカー(イソレク?…
Discussion
私たちの研究室では、網膜微小血管機能障害を促進する病態生理学的変化を31、32、33、34、35、36年間研究してきました。網膜外植片は、糖尿病性網膜症や変性網膜疾患などの網膜疾患を研究するためのモデルとして使用するのに非常に価値のあ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
国立衛生研究所(NIH)の国立眼科研究所への資金提供助成金(R01 EY030054)からモハメド・アル・シャブラウェイ博士に感謝します。ビデオナレーションを手伝ってくれたキャシー・ウォロシェヴィッチに感謝します。オークランド大学眼科研究所小児網膜研究所のケン・ミットン博士には、手術用顕微鏡の使用と記録にご協力いただき、ありがとうございました。このビデオは、ハレド・エルマスリー博士によって編集および監督されました。
Materials
| Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
| All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
| B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
| Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
| DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
| Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
| GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
| Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
| Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
| N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
| Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
| Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
| PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
| Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
| Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
| Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
| TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |
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Cite This Article
Elmasry, K., Moustafa, M., Al-Shabrawey, M. Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases. J. Vis. Exp. (190), e63966, doi:10.3791/63966 (2022).