Herstellung hochoffenporiger Mikrokugeln (HOPMs) mittels mikrofluidischer Technologie

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung von hochoffenen porösen Mikrosphären (HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) mittels der auf einer Einzelemulsionsformulierung basierenden einfachen mikrofluidischen Technologie. Diese Mikrosphären haben potenzielle Anwendungen im Tissue Engineering und im Arzneimittelscreening.

Zusammenfassung

Im Vergleich zu Massengerüsten und der direkten Injektion von Zellen allein haben die injizierbaren modularen Einheiten aufgrund der Bequemlichkeit bei der Verpackung von Zellen, einer verbesserten Zellretention und minimaler Invasivität ein enormes Interesse an der Reparatur von Fehlfunktionen geweckt. Darüber hinaus könnte die poröse Konformation dieser mikroskaligen Träger den Medienaustausch verbessern und das Niveau der Nährstoffe und Sauerstoffversorgung verbessern. Die vorliegende Studie veranschaulicht die bequeme Herstellung von hochoffenporigen Mikrokügelchen (PLGA-HOPMs) auf Basis von Poly(Milchsäure-Co-Glykolsäure) durch die einfache mikrofluidische Technologie für Zellabgabeanwendungen. Die resultierenden monodispersen PLGA-HOPMs besaßen Partikelgrößen von ~400 μm und offene Poren von ~50 μm mit miteinander verbundenen Fenstern. Kurz gesagt, die emulgierten Öltröpfchen (PLGA-Lösung in Dichlormethan, DCM), umwickelt mit der 7,5% (w/v) Gelatine-wässrigen Phase, wurden in die 1% (w/v) kontinuierlich fließende Polyvinylalkohol (PVA) wässrige Lösung durch die Koaxialdüse in der maßgeschneiderten mikrofluidischen Anordnung eingebracht. Anschließend wurden die Mikrosphären Lösungsmittelextraktions- und Lyophilisationsverfahren unterzogen, was zur Herstellung von HOPMs führte. Insbesondere verschiedene Formulierungen (Konzentrationen von PLGA und Porogen) und Verarbeitungsparameter (Emulgierleistung, Nadelstärke und Durchflussrate der dispergierten Phase) spielen eine entscheidende Rolle für die Qualitäten und Eigenschaften der resultierenden PLGA-HOPMs. Darüber hinaus könnten diese Architekturen möglicherweise verschiedene andere biochemische Hinweise wie Wachstumsfaktoren für erweiterte Anwendungen in der Arzneimittelforschung und Geweberegeneration kapseln.

Einleitung

Zellbeladene Mikrosphären bieten günstige Vorteile, wie z. B. eine verbesserte Zellretentionskapazität in situ, eine effiziente Lieferung von Zellen und die anschließende Fähigkeit zur Zellproliferation in vivo¹. Bis heute wurden zahlreiche Untersuchungen zur Entwicklung einer erfolgreichen Gerüststruktur durchgeführt, die eine förderliche Umgebung für Zellen für Geweberegeneration oder Drogenscreening-Anwendungen unterstützt². Die Hypoxie-Umgebung ist jedoch in den Innenräumen aufgrund unzureichender Versorgung mit Nährstoffen / Sauerstoff und der Ansammlung von Stoffwechselabfällen oft unvermeidlich

Protokoll

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Bereiten Sie die PVA-Stammlösung im Voraus vor, indem Sie die PVA-Lösung in einem 80 °C-Wasserbad erhitzen und anschließend bei 4 °C in den Kühlschrank stellen. Abkühlen auf Raumtemperatur (RT) für den experimentellen Einsatz.
2. Die Emulsionsvorstufe wird durch Zugabe der wässrigen Gelatinelösung (1 ml, 7,5%, w/v) zur organischen Phase von PLGA (2 ml, 2%, w/v in Dichlormethan, DCM) hergestellt (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Im Allgemeinen umfasst die mikrofluidische Technologie verschiedene Phasen, um die Mikrosphären zu bilden. Die kontinuierliche oder Sammelphase umfasst ein wäss....

Ergebnisse

Basierend auf früheren Arbeiten zur Optimierung der Hauptparameter¹ wurde PLGA im verdampfbaren DCM-Lösungsmittel gelöst. Die primäre W/O-Emulsion wurde durch Homogenisieren mit Gelatine unter Ultraschallsondenbehandlung hergestellt. Die maßgeschneiderte Co-Flow-Fluidstruktur wurde vereinfacht zusammengesetzt, wobei eine Spritze verwendet wurde, um die Strömungen ständig einzuleiten. Darüber hinaus wurden ausreichende Spülverfahren durchgeführt, um PVA und Gelatine von PLGA-Mikrokugeln zu eliminie.......

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Strategie zur Herstellung von PLGA-basierten Architekturen, nämlich die PLGA-HOPMs. Es ist zu beachten, dass mehrere kritische Schritte sorgfältig unternommen werden müssen, einschließlich der Vermeidung der Lösungsmittelverflüchtigung von PLGA und der sanften Anpassung der Ultraschallleistung an die Zielposition während der Herstellung der Emulsion. Darüber hinaus kann der Flüssigkeitsaustritt der 20-ml-Spritze bis zu einem gewissen Grad eingestellt werden, um die Phasentrennung.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zentrifugenröhrchen	Solarbio, Peking, China		5 mL & 50 mL (Sterilität)
Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie	Leica, Wetzlar, Deutschland		TCS SP8
Dichlormethan	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20161110	Dosiernadel in Forschungsqualität
	Kindly, Shanghai, China		: 250 μ m, AD: 460 μ m
DMEM/F-12	Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA	15400054	DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) mit L-Glutamin-Ethylalkohol
	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China	20210918	Forschungsqualität
Ethyl-Endiamintetraessigsäure (EDTA)-Trypsin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra		Trypsin (0,25%), EDTA (0,02%)
Fötales Rinderserum (FBS)	Biological Industries, Kibbuz Beit-Haemek, Isra		Gefriertrockner in Forschungsqualität
	Bilon, Shanghai, China		FD-1B-50
Gelatine	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	Los # SZBF2870V	Aus Schweinehaut, Typ A
Glasbodenplatte	Biosharp, Hefei, China		BS-15-GJM, 35 mm
Glaskapillare	Huaou, Jiangsu, China		0,9-1,1 & mal 120 mm
Inkubator-Schüttler	Zhicheng, Shanghai, China	ZWYR-200D
Bildgebungskit für lebende tote Zellen	Solarbio, Peking, China	60421211112	Grüne Fluoreszenz in lebenden Zellen (ex/em 488 nm/515 nm). Rote Fluoreszenz in toten Zellen (ex/em 570 nm/602 nm)
Niedrigdrehzahlzentrifuge	Xiangyi, Hunan, China		TD5A
Magnetron-Sputter	Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China	MSP-2S Mikroflow-Injektionspumpe
	Harvard Apparatus, Holliston, USA		Harvard-Pumpe 11 Plus
Penicillin-Streptomycin	Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israelis	2135250	Forschungsqualität
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China	GP21090181556	PBS 1x, Kulturqualität, kein Calcium, kein Magnesium
Poly(milchsäure-co-Glykolsäure)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	Los# MKCF9651	66– 107 kDa, Lactid:Glykolid 75:25
Poly(vinylalkohol)	Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA	Los# MKCK4266	13-13 kDa, 98% hydrolysiertes PVC-Rohr
	Shenchen, Shanghai, China		Innendurchmesser, ID: 1 mm
Rattenknochenmark-Mesenchyml-Stammzellen	Procell, Wuhan, China
Rasterelektronenmikroskop	Phenom pure, Eindhoven, Niederlande		Stellen Sie die Beschleunigungsspannung bei 5 kV
Spritze für medizinische Zwecke	ein Kindly, Shanghai, China		5 mL & 50 mL (mit der Nadel)
Temperatur Wasserbad	Mingxiang, Shenzhen, China		36 W
Transformator	Riye Electric Co. Ltd, Suzhou, China	SZ-2KVA
Ultraschall-Zellbrecher	JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China		JY 92-IID
UV-härtender Kleber	Zhuolide, Foshan, China		D-3100

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