हम परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सामान्य और रोगग्रस्त यकृत में कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों के लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी का एक साथ उपयोग यकृत वर्गों में कोलेजन युक्त क्षेत्रों के स्थानीयकरण के लिए उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करता है।
मैट्रिक्स कठोरता को यकृत फाइब्रोसिस की प्रगति के प्रमुख ड्राइवरों में से एक के रूप में मान्यता दी गई है। इसका सेल व्यवहार के विभिन्न पहलुओं जैसे सेल फ़ंक्शन, भेदभाव और गतिशीलता पर गहरा प्रभाव पड़ता है। हालांकि, चूंकि ये प्रक्रियाएं पूरे अंग में सजातीय नहीं हैं, इसलिए सेलुलर स्तर पर ऊतकों के यांत्रिक गुणों में परिवर्तन को समझना तेजी से महत्वपूर्ण हो गया है।
यकृत लोब के भीतर कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता की निगरानी करने में सक्षम होने के लिए, यह पेपर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा उच्च स्थानिक परिशुद्धता के साथ यकृत ऊतक लोचदार मोडुलिन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। एएफएम स्थानीय यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने की क्षमता के साथ एक संवेदनशील विधि है, जिसकी गणना यंग (लोचदार के रूप में भी जाना जाता है) मापांक के रूप में की जाती है। ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित एएफएम का उपयोग विशेष रूप से ऊतकों में कोलेजन फाइबर के विघटन के आधार पर फाइब्रोसिस विकास के क्षेत्रों का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने फाइब्रोटिक माउस लिवर से कोलेजन युक्त क्षेत्रों की कठोरता और नियंत्रण चूहों के यकृत में संबंधित क्षेत्रों की विशेषता बताई।
फाइब्रोसिस विकास के साथ कोलेजन-पॉजिटिव क्षेत्रों की कठोरता में एक प्रमुख वृद्धि देखी गई थी। प्रस्तुत प्रोटोकॉल हल्के रूप से निश्चित यकृत ऊतक के उपयोग के कारण एएफएम माप की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि की अनुमति देता है, जिसका उपयोग स्थानीय ऊतक यांत्रिक गुणों में रोग-शुरू किए गए परिवर्तनों और पड़ोसी कोशिकाओं के भाग्य पर उनके प्रभाव की समझ को आगे बढ़ाने के लिए किया जा सकता है।
जीवों में होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए यकृत एक महत्वपूर्ण अंग है 1,2. क्रोनिक लीवर रोग सालाना दुनिया भर में ~ 2 मिलियन मौतों के लिए जिम्मेदारहैं। वे आमतौर पर वायरल संक्रमण, ऑटोइम्यून विकार, चयापचय सिंड्रोम, या शराब के दुरुपयोग से संबंधित बीमारियों के रूप में उत्पन्न होते हैं और प्रगतिशील यकृत फाइब्रोसिस के साथ होते हैं। जिगर की चोट एक भड़काऊ प्रतिक्रिया प्राप्त करती है, जो घाव भरने की प्रतिक्रिया में बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जमा करने वाली कोशिकाओं की सक्रियता की ओर जाता है। हालांकि, एक पुराने अपमान की उपस्थिति में, अतिरिक्त ईसीएम यकृत के भीतर अनसुलझे निशान ऊतक बनाता है, जिससे यकृत फाइब्रोसिस, सिरोसिस, यकृत कार्सिनोमा और अंततः, यकृत विफलताका विकास होता है।
हेपेटोसाइट की चोट के परिणामस्वरूप तुरंत यकृत कठोरता बढ़जाती है 5,6. यह सीधे हेपेटोसाइट फ़ंक्शन को प्रभावित करता है, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं (एचएससी) और पोर्टल फाइब्रोब्लास्ट को सक्रिय करता है, और इसके परिणामस्वरूप कोलेजन-जमा मायोफाइब्रोब्लास्ट 7,8 के लिए उनका ट्रांसडिफरेंटेशन होता है। रेशेदार ईसीएम का जमाव यकृत कठोरता को और बढ़ाता है, जिससे यकृत कठोरता और मैट्रिक्स-उत्पादक सेल सक्रियण का एक आत्म-प्रवर्धन प्रतिक्रिया लूप बनता है।
इस प्रकार, यकृत कठोरता यकृत रोग के पूर्वानुमान में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर बन गई है। बायोमेकेनिकल ऊतक गुणों में परिवर्तन का पता हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा फाइब्रोसिस से पहले लगाया जा सकता है। इसलिए, अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों दोनों में यकृत कठोरता माप के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया है। नैदानिक सेटिंग्स में, क्षणिक इलास्टोग्राफी (टीई) 9,10,11,12,13 और चुंबकीय अनुनाद इलास्टोग्राफी (एमआरई) 14,15,16,17,18 को सकल यकृत कठोरता 19 की जांच करके यकृत क्षति के शुरुआती चरणों का गैर-आक्रामक रूप से निदान करने के लिए नियोजित किया गया है।
टीई में, हल्के आयाम और कम आवृत्ति (50 हर्ट्ज) की अल्ट्रासाउंड तरंगों को यकृत के माध्यम से प्रचारित किया जाता है, और उनके वेग को मापा जाता है, जिसका उपयोग तब ऊतक लोचदार मापांक13 की गणना करने के लिए किया जाता है। हालांकि, यह तकनीक यकृत के आसपास के ऊतकों के माध्यम से अल्ट्रासाउंड तरंगों के अनुचित संचरण के कारण जलोदर, मोटापा, या कम इंटरकोस्टल रिक्त स्थान वाले रोगियों के लिए उपयोगी नहींहै।
एमआरई चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग पद्धति पर आधारित है और यकृत को लक्षित करने के लिए 20-200 हर्ट्ज यांत्रिक कतरनी तरंगों का उपयोग करता है। एक विशिष्ट चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग अनुक्रम का उपयोग तब ऊतक के अंदर तरंगों का पता लगाने और ऊतक कठोरता 16 की गणना करने के लिए कियाजाता है। टीई और एमआरई दोनों तकनीकों के साथ रिपोर्ट किए गए कठोरता मूल्य हिस्टोलॉजिकल मेटावीर स्कोर20 (तालिका 1) का उपयोग करके रैंक किए गए मानव यकृत नमूनों की बायोप्सी से प्राप्त यकृत फाइब्रोसिस की डिग्री के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित हैं। टीई और एमआरई को अनुसंधान उद्देश्यों के लिए कृंतक मॉडल में यकृत कठोरता के माप के लिए भी अनुकूलित किया गया है 21,22,23। हालांकि, चूंकि दोनों विधियां प्रसार कतरनी तरंगों के लिए ऊतक की प्रतिक्रिया से कठोरता मूल्यों को प्राप्त करती हैं, इसलिए प्राप्त मूल्य ऊतक की पूर्ण यांत्रिक कठोरता को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं।
कृंतक यकृत के प्रत्यक्ष यांत्रिक लक्षण वर्णन के लिए, बार्न्स एट अल ने एक मॉडल-जेल-ऊतक परख (एमजीटी परख) विकसित किया जिसमें पॉलीक्रिलामाइड जेल24 में यकृत ऊतक का एम्बेडिंग शामिल है। यह जेल एक स्पंदित समान बल द्वारा संपीड़ित होता है जिससे यंग के मापांक की गणना की जा सकती है। एमजीटी परख सामान्य और फाइब्रोटिक लीवर24 (तालिका 1) दोनों के लिए अनुकूलित इंडेंटेशन परख के साथ एक अच्छा सहसंबंध दिखाती है।
तालिका 1: थोक स्तर पर यकृत कठोरता मान। टीई और एमआरई की तुलना विभिन्न स्रोतों से लिवर के लिए इंडेंटेशन और एमजीटी परख का उपयोग करके यकृत लोचदार मोडुलिन के प्रत्यक्ष पूर्व विवो यांत्रिक मापों से की जाती है। E और G के बीच संबंध E = 2G (1 + v) द्वारा दिया गया है, जहां v नमूने का पॉइसन अनुपात है; एफ 0 से एफ 4 मेटावीर स्कोरिंग सिस्टम में फाइब्रोसिस स्कोर का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें एफ 0 कम या कोई फाइब्रोसिस और एफ 4 सिरोटिक लिवर को दर्शाता है। संक्षेप: टीई = क्षणिक इलास्टोग्राफी; एमआरई = चुंबकीय अनुनाद इलास्टोग्राफी; एमजीटी = मॉडल-जेल-ऊतक; ई = लोचदार (यंग) मापांक; जी = कतरनी मापांक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
जेनेरिक यकृत कठोरता माप की प्रमुख कमियों में से एक यह है कि वे यकृत में कठोरता विषमता के सेलुलर-स्तरीय संकल्प प्रदान नहीं करते हैं। फाइब्रोसिस की प्रगति के दौरान, कोलेजन युक्त क्षेत्र आसपास के पैरेन्काइमा25,26 की तुलना में उच्च कठोरता दिखाते हैं। यह कठोरता ढाल स्थानीय रूप से निवासी कोशिकाओं को प्रभावित करती है और एचएससी विषमता 27 को चलाने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती है। इस प्रकार, फाइब्रोसिस प्रगति को बेहतर ढंग से समझने के लिए यकृत रोग के विकास के दौरान स्थानीय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन को सूक्ष्म स्तर पर विशेषता दी जानी चाहिए।
एएफएम ऊतक के यांत्रिक गुणों को उच्च रिज़ॉल्यूशन और उच्च बल संवेदनशीलता के साथ मापा जाने की अनुमति देता है। एएफएम एक कैंटिलीवर की नोक का उपयोग एक नमूने की सतह को कई पिकोन्यूटन के रूप में कम बलों के साथ चिह्नित करने के लिए करता है, जो नियोजित नोक की ज्यामिति और आकार के आधार पर सूक्ष्म या नैनोस्कोपिक स्तर पर विरूपण को प्रेरित करता है। लागू तनाव के लिए नमूने की बल प्रतिक्रिया को तब कैंटिलीवर28 में विक्षेपण के रूप में मापा जाता है। फोर्स-विस्थापन वक्रों को कैंटिलीवर के दृष्टिकोण और वापसी से एकत्र किया जाता है, जिसे नमूना29 की स्थानीय कठोरता का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त संपर्क यांत्रिकी मॉडल के साथ फिट किया जा सकता है।
किसी दिए गए क्षेत्र की कठोरता को मापने के अलावा, एएफएम नमूने में विशिष्ट विशेषताओं के बारे में स्थलाकृतिक जानकारी भी प्रदान कर सकता है, जैसे कोलेजन फाइबर की संरचना 30,31,32। कई अध्ययनों ने रोगी और माउस मॉडल नमूनों दोनों से त्वचा32,33, फेफड़े 34,35, मस्तिष्क36, स्तन 37,38,39, उपास्थि 40, या हृदय 41,42,43,44 जैसे विभिन्न स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों की कठोरता को मापने के लिए एएफएम के आवेदन का वर्णन किया है। इसके अलावा, एएफएम का उपयोग कोशिकाओं की कठोरता और बाह्य प्रोटीन मचानों45,46,47 को निर्धारित करने के लिए विट्रो में भी किया गया है।
एएफएम का उपयोग करके जैविक नमूनों के यांत्रिक गुणों का माप उनकी कोमलता और नाजुकता के कारण महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, विभिन्न अध्ययनों ने विभिन्न स्थितियों और सेटिंग्स को मानकीकृत किया है, जो यंग के मोडुलिन (मैककी एट अल.48 द्वारा समीक्षा) के व्यापक रूप से उतार-चढ़ाव वाले मूल्यों को उत्पन्न करते हैं। अन्य नरम ऊतकों के समान, यकृत फाइब्रोसिस के विभिन्न ग्रेड में लिवर यंग के मापांक मान भी व्यापक भिन्नता दिखाते हैं (तालिका 2)। यंग के मापांक मूल्यों में अंतर एएफएम ऑपरेशन, कैंटिलीवर टिप, नमूना तैयारी विधि, नमूना मोटाई, इंडेंटेशन गहराई और बलों, माप के दौरान यकृत ऊतक वातावरण और विश्लेषण विधि (तालिका 2) के मोड में अंतर से उत्पन्न होता है।
तालिका 2: सेलुलर स्तर पर यकृत कठोरता मान। एएफएम का उपयोग करके प्राप्त यकृत कठोरता मूल्य सेलुलर स्तर पर यकृत के यांत्रिक गुणों का वर्णन करते हैं। संक्षेप: एएफएम = परमाणु बल माइक्रोस्कोपी; ई = लोचदार (यंग) मापांक; पीएफए = पैराफॉर्मलडिहाइड; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
यह पेपर ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी के उपयोग द्वारा प्रदान किए गए सटीक स्थानीयकरण के साथ एएफएम द्वारा यकृत ऊतक में कोलेजन युक्त फाइब्रोटिक क्षेत्रों के यंग के मोडुलिन के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। हमने कार्बन टेट्राक्लोराइड (सीसीएल4) को एक माउस मॉडल में सेंट्रीलोबुलर फैशन49 में कोलेजन जमाव को प्रेरित करने के लिए प्रशासित किया, जो मानव यकृत फाइब्रोसिस50 के महत्वपूर्ण पहलुओं की मज़बूती से नकल करता है। ध्रुवीकृत सूक्ष्म छवियां कोलेजन फाइबर51 के विघटन के कारण यकृत में कोलेजन के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम करती हैं, जो हेपेटिक लोब्यूल52 के भीतर रुचि के वांछित क्षेत्र पर कैंटिलीवर टिप की सटीक स्थिति की अनुमति देती है।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल सामान्य और फाइब्रोटिक माउस यकृत ऊतक के एएफएम माप के लिए एक चरण-दर-चरण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि प्रदान करता है। युग्मित ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी उच्च स्थानिक परिशुद्धता प्रदान करती है और कोलेजन फाइबर के विज़ुअलाइज़ेशन को उनके विघटन के कारण सक्षम बनाती है। इसके अलावा, प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण का विस्तृत विवरण प्रदान किया गया है। एएफएम कठोरता माप सेलुलर स्तर पर किया जा सकता है, जो फाइब्रोटिक रोग के विकास के कारण यकृत ऊतक यांत्रिक गुणों में स्थानीय परिवर्तनों की निगरानी करने की अनुमति देता है। लिवर फाइब्रोसिस पूरे अंग को प्रभावित करने वाली एक सजातीय प्रक्रिया नहीं है। इसके विपरीत, कोलेजन युक्त फाइब्रोटिक सेप्टा के क्षेत्रों को कम या बिना कोलेजन जमा वाले क्षेत्रों के साथ जोड़ा जाता है। इस प्रकार, कठोरता परिवर्तन स्थानीय माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए विशिष्ट हैं और केवल चोट से क्षतिग्रस्त क्षेत्रों के संपर्क में स्थानीय रूप से कोशिकाओं को प्रभावित करते हैं। कठोरता विषमता का यह माइक्रोस्केल एएफएम यंग के मापांक मानचित्रों के विवरण में भी स्पष्ट है, जहां उच्च कठोरता के बिंदु लगभग सामान्य कठोरता के क्षेत्रों की सीमा बनाते हैं। इस भिन्नता से पता चलता है कि यहां तक कि कोलेजन निशान ऊतक क्षेत्र यांत्रिक रूप से सजातीय नहीं है और सेलुलर स्तर पर एएफएम माप की विशेषता की आवश्यकता होती है (चित्रा 4)।
प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत संग्रह से स्वतंत्र रूप से एएफएम द्वारा यकृत कठोरता के माप की अनुमति देता है, क्योंकि ओसीटी में एम्बेडेड पूरे यकृत लोब को -80 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, एक बार ऊतक को विभाजित करने के बाद, हम ~ 2 सप्ताह के भीतर नमूनों को मापने की सलाह देते हैं क्योंकि हमने लंबे समय तक संग्रहीत ऊतक वर्गों के क्रमिक नरम होने को देखा है (चित्रा 5)।
ध्रुवीकरण माइक्रोस्कोपी से लैस एएफएम यकृत लोब्यूल संरचना के भीतर रुचि के क्षेत्र का सटीक पता लगाने की अनुमति देता है। हालांकि, इसकी कुछ सीमाएं भी हैं जिन्हें परिणामों की व्याख्या करते समय विचार करने की आवश्यकता है। यहां प्राप्त कठोरता मूल्यों को कमरे के तापमान पर मापा गया था। हम मानते हैं कि नरम ऊतक के यांत्रिक गुणों पर तापमान का प्रभाव छोटा होगा; हालांकि, यह यकृत ऊतकों के यांत्रिक गुणों के विवो मूल्यों और इस अध्ययन में मूल्यों के बीच अंतर के कारणों में से एक हो सकता है।
इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल 3 घंटे तक यकृत ऊतक के एएफएम विश्लेषण की अनुमति देता है, जिसके लिए ऊतक के हल्के निर्धारण की आवश्यकता होती है। ऊतक वर्गों के हल्के निर्धारण, साथ ही फ्रीज-पिघलना चक्र, यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों को प्रभावित करेगा। इस प्रकार, यंग के मोडुलिन के रिपोर्ट किए गए मूल्य विवो मूल्यों से भिन्न हो सकते हैं। यकृत वर्गों से यंग के मापांक के पूर्ण मूल्यों के माप के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है, जिसे यकृत ऊतक64 के निर्धारण के लिए एक अलग विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।
बहरहाल, हमने 6 सप्ताह की तुलना में 3 सप्ताह के लिए सीसीएल4 के साथ इलाज किए गए चूहों के यकृत में कोलेजन युक्त क्षेत्रों की बढ़ती कठोरता देखी। इस तरह के परिवर्तन लंबे समय तक चोट के दौरान फाइब्रोसिस प्रगति के अनुरूप होते हैं (चित्रा 4) और दिखाते हैं कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके विभिन्न उपचारों के बीच सापेक्ष अंतर की जांच की जा सकती है। यह कैलो एट अल के अवलोकनों के साथ सहमति में है, जिन्होंने दिखाया कि हल्के से निश्चित यकृत खंड कोलेजन युक्त और कोलेजन की कमी वाले क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान अंतर दिखाते हैं जैसा कि ताजा ऊतक25 में होता है।
हमने माप के दौरान यकृत ऊतक के यांत्रिक व्यवधान को कम करने के लिए 5.7 μm व्यास गोलाकार टिप के साथ संशोधित एसडी-क्यूपी-बायोटी-टीएल -10 कैंटिलीवर (सैद्धांतिक स्प्रिंग स्थिरांक ~ 0.09 एन / एम) का उपयोग किया। एक 5.7 μm मोती ने इसकी अखंडता को संरक्षित करते हुए इसकी कठोरता की जांच करने के लिए नमूने के पर्याप्त इंडेंटेशन को सक्षम किया। कठोरता मानचित्रों में उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त करने के लिए कई अनुकूलनों के बाद, एक छोटे व्यास वाले मोती का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यंग के मापांक मूल्यों की और अधिक अतिवृद्धि हो सकती है (अधिक जानकारी के लिए, देखें क्रिचटन एट अल.65)। निर्दिष्ट कैंटिलीवर-बीड पहनावा का उपयोग करके, हम पीए की दसियों इकाइयों से ~ 100 केपीए तक, एक विस्तृत श्रृंखला में नमूना कठोरता को चिह्नित करने में सक्षम थे।
स्नेडन के मॉडल का उपयोग बल वक्रों से यंग के मापांक को प्राप्त करने के लिए किया गया था, क्योंकि यह कोलाइडल जांच62 के साथ गहरे इंडेंटेशन के विश्लेषण की अनुमति देता है। हर्ट्ज के मॉडल के विपरीत स्नेडन का मॉडल, इस बाधा से ग्रस्त नहीं है कि संपर्क त्रिज्या गोले त्रिज्या की तुलना में बहुत छोटी होनी चाहिए। यह आगे मानता है कि नमूना मोटाई इंडेंटेशन गहराई30,66 से कई गुना अधिक है। वर्तमान अध्ययन में, इंडेंटेशन ~ 2 μm था जिसमें 5.7 μm के मोती का आकार और कोलेजन समृद्ध क्षेत्रों में 30 μm की नमूना मोटाई थी; इस प्रकार, स्नेडन का मॉडल उपयुक्त था। टिप और सब्सट्रेट के बीच आसंजन बल पर विचार करने वाले अन्य मॉडल63 का उपयोग विभिन्न प्रकार के ऊतकों के लिए किया जा सकता है।
एटॉमिकजे में विश्लेषण यंग के मापांक62,67 को प्राप्त करते हुए सब्सट्रेट के योगदान को कम करने के लिए नमूनों की परिमित मोटाई के लिए सुधार लागू करता है। प्राप्त बल वक्रों के विश्लेषण में, हमने 0.45 के एकल पोइसन अनुपात का उपयोग किया, जिसे पहले नरम ऊतकअंगों 24 के लिए अनुशंसित किया गया था। इस सन्निकटन का यंग के मापांक के परिकलित मूल्यों पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं पड़ता है, क्योंकि पोइसन के अनुपात के मान में 0.4 से 0.5 तक परिवर्तन के परिणामस्वरूप स्नेडन के समीकरण के अनुसार गणना किए गए यंग के मापांक मानों में केवल 0.893x की कमी होती है। सीसीएल 4 उपचारों की विभिन्न अवधियों के बीच यंग के मापांक में कई गुना अंतरको देखते हुए, पोइसन के अनुपात को अनुमानित करके उत्पन्न त्रुटियां केवल मामूली हैं।
हमने कठोरता मूल्यों की गणना करने के लिए वापस वक्रों का उपयोग किया, क्योंकि हम इंडेंटेशन68 के लिए प्लास्टिक प्रतिक्रिया के बजाय कैंटिलीवर द्वारा प्रदान किए गए भार के लिए ऊतक की लोचदार प्रतिक्रिया में रुचि रखते थे। नरम ऊतक की विस्कोस्टिक प्रतिक्रिया के कारण, वापसी वक्रों को फिट करना यंग के मापांक को अधिक महत्व दे सकता है, जिसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, हमने देखा है कि दृष्टिकोण वक्रों के साथ डेटा विश्लेषण फाइब्रोटिक और नियंत्रण क्षेत्रों के बीच कठोरता मूल्यों में समान रुझान पैदा करता है, हालांकि पूर्ण मान तदनुसार कम हैं (डेटा नहीं दिखाया गया है)।
प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, हमने माप की प्रजनन क्षमता के लिए महत्वपूर्ण कई चरणों की पहचान की। सबसे पहले, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि कैंटिलीवर से संलग्न करते समय मोती लगभग पारभासी नोक के केंद्र में है। यह इंडेंटेशन के दौरान संभावित यांत्रिक असंतुलन को रोकता है। दूसरा, पीएफए के साथ यकृत निर्धारण के दौरान, पिघलने और निर्धारण के लिए समय सीमा का सख्ती से पालन करना आवश्यक है। इस चरण के समय को बदलना ऊतक वर्गों के यांत्रिक गुणों को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकता है। तीसरा, तापमान में उतार-चढ़ाव के कारण कठोरता मूल्यों में होने वाली किसी भी कलाकृतियों से बचने के लिए कैंटिलीवर को समवर्ती तापमान मूल्यों की निरंतर निगरानी और इनपुट के साथ बार-बार कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। अंत में, एक एकल यकृत अनुभाग को तैयारी से 3 घंटे से अधिक समय तक नहीं मापा जाना चाहिए, क्योंकि ओवरलेड पीबीएस लंबी अवधि में वाष्पित हो सकता है। पाठक एएफएम माप के दौरान आने वाली समस्याओं को हल करने के लिए समस्या निवारण तालिका (तालिका 3) का उल्लेख कर सकते हैं, जिसकी चर्चा नॉर्मन एट अल.46 में भी की गई है।
तालिका 3: समस्या निवारण मार्गदर्शिका. कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
प्रस्तुत प्रोटोकॉल यकृत ऊतक की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एएफएम जांच की अनुमति देता है। इसमें सूक्ष्म स्तर पर फाइब्रोटिक यकृत रोग के विकास और अंतिम प्रतिगमन पर जानकारी प्रकट करने की क्षमता है और पुरानी यकृत रोग की प्रगति के दौरान गठित फाइब्रोटिक निशान क्षेत्रों को लक्षित करने वाले उपचारों के विकास में योगदान कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को चेक गणराज्य की अनुदान एजेंसी (18-02699 एस), चेक एकेडमी ऑफ साइंसेज (आरवीओ 68378050) की संस्थागत अनुसंधान परियोजना और एमईवाईएस सीआर परियोजना एनआईसीआर एक्सेलेस (एलएक्स 22 एनपीओ 05102) द्वारा समर्थित किया गया था। सीआईआईएसबी, इंस्ट्रक्ट-सीजेड सेंटर ऑफ इंस्ट्रक्ट-एरिक ईयू कंसोर्टियम, एमईवाईएस सीआर इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोजेक्ट एलएम 2018127 और यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि-परियोजना “यूपी सीआईआईएसबी” द्वारा वित्त पोषित है। CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0015974) ने सीएफ नैनोबायोटेक्नोलॉजी, CEITEC MU में माप का वित्तीय रूप से समर्थन किया। हम लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, आईएमजी सीएएस, प्राग, चेक गणराज्य को भी स्वीकार करते हैं, जो एमईवाईएस (एलएम 2018129, सीजेड.02.1.01/0.0/0.0/18_046/0016045) और आरवीओ: 68378050-केएवी-एनपीयूआई द्वारा समर्थित है।
AFM head | Bruker | JPK nanowizard 3 | |
Cameras | Andor | Zyla 5.5 USB (sCMOS, water cooled) | |
The Imagingsource | S/N:12310015 | ||
Cantilever | SD-qp-BioT-TL-10, Nanosensors | S/N:73750F05 | |
Cryotome | Leica | CM1950 | |
Epoxy resin glue (Long working time ) | Bison epoxy universal | ||
Melamine beads; diameter, 5.7 um | Microparticles, GmbH | MF-R-5.7 | |
Microscope | Olympus | IX81 | |
Hydrophobic slide marker | SuperHT | PAP PEN | |
Software | JPK nanowizard v6.1.151 | ||
AtomicJ v2.3.1 | |||
Superfrost slides | Thermoscientific | ref no. J1800AMNZ | |
System | Ubuntu 14.04.5 LTS | ||
Vibration isolation control unit | Tablestable | AVI-200-S |