Tarmmikrober, inkludert ekstracellulære bakterier og intracellulære patogener som Orsay-viruset og mikrosporidia (sopp), er ofte forbundet med ville Caenorhabditis nematoder . Denne artikkelen presenterer en protokoll for å oppdage og kvantifisere mikrober som koloniserer og/eller infiserer C. elegans nematoder, og for måling av patogenbelastning etter kontrollerte infeksjoner i laboratoriet.
Tarmene av ville Caenorhabditis nematoder er bebodd av en rekke mikroorganismer, inkludert tarmmikrobiombakterier og patogener, som mikrosporidia og virus. På grunn av likhetene mellom Caenorhabditis elegans og pattedyrs tarmceller, samt kraften til C. elegans-systemet , har denne verten dukket opp som et modellsystem for å studere vertstarm-mikrobe-interaksjoner in vivo. Selv om det er mulig å observere noen aspekter av disse interaksjonene med lysfeltmikroskopi, er det vanskelig å klassifisere mikrober nøyaktig og karakterisere omfanget av kolonisering eller infeksjon uten mer presise verktøy. RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan brukes som et verktøy for å identifisere og visualisere mikrober i nematoder fra naturen eller for å eksperimentelt karakterisere og kvantifisere infeksjon i nematoder infisert med mikrober i laboratoriet. FISH-sonder, som merker den svært tallrike lille underenheten ribosomalt RNA, produserer et lyst signal for bakterier og mikrosporidiske celler. Sonder designet for å målrette konserverte regioner av ribosomalt RNA som er felles for mange arter, kan oppdage et bredt spekter av mikrober, mens målretting av divergerende regioner av ribosomal RNA er nyttig for smalere deteksjon. På samme måte kan prober utformes for å merke viralt RNA. En protokoll for RNA FISH-farging med enten paraformaldehyd (PFA) eller acetonfiksering presenteres. PFA-fiksering er ideell for nematoder assosiert med bakterier, mikrosporidier og virus, mens acetonfiksering er nødvendig for visualisering av mikrosporidasporer. Dyr ble først vasket og festet i paraformaldehyd eller aceton. Etter fiksering ble FISH-sonder inkubert med prøver for å muliggjøre hybridisering av sonder til ønsket mål. Dyrene ble igjen vasket og deretter undersøkt på mikroskopglass eller ved hjelp av automatiserte tilnærminger. Samlet sett muliggjør denne FISH-protokollen deteksjon, identifisering og kvantifisering av mikroberene som bor i C. elegans tarm, inkludert mikrober som det ikke finnes genetiske verktøy for.
Caenorhabditis elegans har dukket opp som et kraftig modellsystem for å studere medfødt immunitet og vert-mikrobe-interaksjoner i tarmepitelcellene 1,2. På grunn av å ha en gjennomsiktig kropp og bare 20 tarmceller, representerer C. elegans et praktisk system for overvåking av prosessene for mikrobiell intestinal kolonisering og infeksjon i sammenheng med en intakt organisme. Nematode tarmceller deler flere morfologiske og funksjonelle likheter med pattedyrs tarmepitelceller, noe som gjør dem til en trekkbar in vivo-modell for disseksjon av prosesser som styrer mikrobiomkolonisering og patogeninfeksjon 3,4,5,6.
Wild C. elegans spiser på en rekke mikrober som koloniserer og infiserer tarmen, og prøvetaking av disse nematoder har resultert i oppdagelse av virus, eukaryoter (sopp, oomycetes) og bakterier som naturlig forbinder med denne verten 7,8,9,10. Orsay-viruset ble funnet å infisere tarmen og er for tiden det eneste kjente naturlige viruset av C. elegans9. Microsporidia er sopprelaterte obligatoriske intracellulære patogener som er den vanligste infeksjonen i villfanget Caenorhabditis, med flere arter som har blitt oppdaget infisere C. elegans og relaterte nematoder 8,11. Mange bakterier er ofte funnet i tarmlumen av villfangede C. elegans, og flere arter er etablert som en naturlig modell for C. elegans mikrobiom (CeMbio) 6,12,13,14. Å oppdage og karakterisere mikrober som naturlig koloniserer og / eller infiserer C. elegans er avgjørende for å forstå de genetiske mekanismene som styrer disse vertsmikrobeinteraksjonene, samt visualisere nye mikrobielle prosesser som bare forekommer i sammenheng med et intakt vertsdyr.
Etter prøvetaking screenes ville nematoder via differensialinterferenskontrastmikroskopi (DIC) for å se etter fenotyper som indikerer infeksjon eller kolonisering. For eksempel kan endringer i det stereotype granulerte utseendet til tarmcellene være forbundet med tilstedeværelsen av en intracellulærparasittinfeksjon. Spesielt er tap av tarmgranulat og redusert cytosolisk viskositet tegn på virusinfeksjon, mens omorganisering av tarmgranulat til “spor” kan indikere infeksjon med mikrosporidia i slekten Nematocida 8,9. Fordi det finnes et bredt utvalg av mikrober i ville C. elegans-prøver, kan det være vanskelig å skille mellom mikrober gjennom DIC-mikroskopi. Informasjon om den romlige fordelingen av mikrober i verten kan også være vanskelig å oppdage på grunn av den lille størrelsen på mange mikrober15. I tillegg er det ikke alltid mulig å dyrke bestemte mikrober av interesse in vitro, noe som fører til vanskeligheter med deteksjon og / eller kvantifisering.
RNA-fluorescens in situ hybridisering (FISH) gir en metode for fluorescerende merking av mikrober ved å benytte fluorescerende prober som binder seg til RNA av den lille ribosomale underenheten (SSU) i faste celler. Hvis analyse av morfologiske egenskaper antyder en bestemt klasse mikrobe, kan FISH-sonder som retter seg mot spesifikke eller brede klasser av slike mikrober brukes. For eksempel regnes EUB338 som en universell sonde for bakteriell SSU og brukes ofte til å oppdage et bredt spekter av bakterier16. Protokollen beskrevet her bruker enkeltstrengede DNA-sonder som er sluttmerket med en fluorofor og spesielt designet for å være komplementære til mål-SSU av mikroben av interesse, selv om det tidligere er designet prober tilgjengelig16. Den største fordelen med å målrette SSU av mikrober er den relativt store overfloden av dette RNA, som vanligvis består av 80% -90% av alt RNA i cellen, noe som fører til farging med et meget høyt signal-til-støy-forhold17. Prober kan også utformes for å målrette RNA for å oppdage virus, som Orsay-viruset 9,18, som ofte er tilstede i svært høye kopier i infiserte celler hvis viruset replikerer aktivt.
Avhengig av resultatene med kjente sonder, kan det være nødvendig å innhente ytterligere sekvensinformasjon for å designe mer spesifikke sonder for artsbekreftelse in situ. En vanlig tilnærming er å bruke universelle primere mot konserverte regioner i SSU (16S for bakterier og 18S for eukaryoter) for å forsterke (via PCR) regioner som er mer divergerende8. Ved hjelp av denne sekvensinformasjonen kan prober med mer artsspesifisitet utformes. Disse FISH-sondene kan da muliggjøre identifisering av mikrober på en kulturuavhengig måte8. I tillegg kan RNA FISH gi innsikt i unike morfologiske koloniserings- og infeksjonsegenskaper, inkludert filamentering eller vevslokaliseringsmønstre19,20. Ulike fargede FISH-sonder kan brukes samtidig, noe som muliggjør visuelt skille mellom mikrober i ville nematodeprøver, samt observasjon av mikrobe-mikrobedynamikk inne i en vert15,20. Videre kan RNA FISH-farging brukes på vertspatogeninteraksjonsstudier der infeksjon og kolonisering av en kjent art enkelt kan kvantifiseres manuelt eller gjennom automatiserte tilnærminger for å gi innsikt i patogenbelastning, for eksempel ved å sammenligne C. elegans-mutanter som enten har økt eller redusert motstand mot infeksjon21.
Wild C. elegans er naturlig forbundet med en rekke mikrober. Forskere kan bruke RNA FISH til å oppdage og identifisere disse mikrober, samt få innsikt i lokaliseringen i sammenheng med et helt dyr. Mikrober med ønskelige eller interessante fenotyper kan identifiseres gjennom denne metoden og deretter isoleres for videre karakterisering og sekvensering. Mengden av mange bakterieisolater fra ville C. elegans kan også kvantifiseres via RNA FISH29. Ved å bruke protokollen som er beskrevet her, er det også mulig å observere kjente mikroorganismer i vertene og lære mer om samspillet deres. Det er viktig at Orsay-virus og mikrosporidia er obligatoriske parasitter og ikke kan dyrkes uavhengig av verten, så FISH er standard visualiseringsverktøy. Kolonisering eller infeksjon kan også kvantifiseres gjennom RNA FISH ved hjelp av nematoder dyrket på plater sådd med en ønsket dyrkbar bakterie av interesse. I tillegg til å farge mikroorganismer i C. elegans tarm, kan denne protokollen brukes til andre nematodestammer som C. tropicalis eller Oscheius tipulae19,23.
Den største fordelen med FISH-protokollen er at den tilbyr en enkel, rask og robust metode for å farge mikrober assosiert med C. elegans. Bilder produsert fra FISH-farging har et høyt signal-til-støy-forhold, som oppnås ved å bruke FISH-sonder som retter seg mot det rikelige RNA-et til SSU i prøven. Fordi det vanligvis er 30x eller høyere nivåer av rRNA enn rDNA, skyldes det meste av signalet fra FISH-farging med sonder som retter seg mot rRNA rRNA i stedet for rDNA30. Videre gjør RNA FISH det mulig å se infeksjon eller kolonisering i sammenheng med hele dyret. Denne visualiseringen forenkles gjennom co-farging av vertskjerner med DAPI og / eller bruk av fluorescerende merkede stammer av C. elegans for bedre å markere lokaliseringen av infeksjon eller kolonisering i prøven. For eksempel ble mikrosporidisk-spesifikk FISH brukt til å bestemme vevstropismen til Nematocida displodere ved å bruke et panel av C. elegans-stammer med GFP-uttrykk i forskjellige vev20. I tillegg er denne protokollen egnet til endringer som gjør det mulig for forskere å bestemme de ideelle forholdene som passer for deres spesifikke behov (for eksempel justering av fikseringsperioden, økning av hybridiseringstemperaturen).
Et kritisk skritt i FISH-protokollen er å fikse prøvene. Inkubasjonsperioden etter tilsetning av fikseringsmiddelet er nødvendig for å gi tid for agenten til å permeabilisere prøven. Lengre inkubasjonstider er ikke ideelle for prøver som inneholder transgene fluorescerende proteiner på grunn av proteinnedbrytning av PFA over tid. For prøver som inneholder GFP, er det viktig å bestemme den optimale fikseringstiden for å tillate permeabilisering, samtidig som GFP-signalet opprettholdes.
FISH kan brukes til å farge for bakterier, virus eller mikrosporidia i C. elegans. Den beste typen fikseringsmiddel som brukes til FISH, avhenger imidlertid av prøven og nedstrømskravene. Denne protokollen presenterer en PFA-løsning som det primære fikseringsmiddelet for å farge bakterier og virus. PFA er imidlertid ikke tilstrekkelig for visualisering av mikrosporidiske sporer, da det ikke kan trenge inn i sporeveggen. For visualisering av sporer, bør aceton brukes i stedet. Selv om PFA-fiksering er effektiv for FISH-merking av andre livsstadier av mikrosporidia, inkludert sporoplasmer, meronter og sporonter. Andre store forskjeller ses mellom acetonfiksering og PFA-fiksering; Aceton er mer praktisk fordi prøver raskt kan lagres i fryseren etter tilsetning, uten behov for vask. Imidlertid dreper aceton raskt eksisterende GFP i en transgen vert. PFA er det foretrukne fikseringsmiddelet hvis det er viktig å bevare noen fysiologiske strukturer i verten, da acetonfikserte dyr ser ut til å være mer nedbrutt, noe som gjør identifisering av noen vev vanskeligere. Fordi prøvene er faste, tillater ikke denne FISH-protokollen levende avbildning av vert-mikrobe-interaksjoner in vivo. Imidlertid kan et pulsjaktende infeksjonsforløp etterfulgt av FISH-farging av prøver på forskjellige tidspunkter tillate en å se en viss dynamikk av mikrobiell infeksjon 19,20,31.
Et annet kritisk skritt gjennom hele protokollen er grundig vasking av prøvene før og etter hybridisering. Før hybridisering, når du samler ormene i mikrofugerørene, kan overskytende bakterier eller andre mikrober fra NGM-platene bæres med ormprøven. Tre vasker med PBS-T er standard; Imidlertid kan det være nødvendig med flere vasker for å eliminere eksterne mikroorganismer tilstrekkelig, spesielt ved bruk av tungt forurensede, vilt isolerte C. elegans. Ved visning av de monterte prøvene etter FISH kan det være noe gjenværende FISH-sonde som gir store mengder signal i bakgrunnen av prøven. Vasketemperaturen og antall vasker er viktig for å fjerne overflødig og ikke-spesifikt bundet sonde. For å redusere bakgrunnsfluorescensen er det mulig å utføre to eller tre vasker med 1 ml WB hvert 30. minutt, i stedet for en vask med 1 ml WB i en time. Ulike FISH-sonder kan kreve forskjellige vasketemperaturer. Vanligvis er vasketemperaturen 2 °C over hybridiseringstemperaturen, men dette kan økes hvis det er for mye bakgrunnsfluorescens (høy støy).
FISH-protokollen bruker fluorescerende prober designet for å målrette mot artsspesifikt mikrobielt RNA, men FISH-sonder kan utformes for andre høykopi-transkripsjoner. Andre FISH-sonder kan ha andre smeltetemperaturer, så inkubasjonstrinn må kanskje utføres ved en høyere eller lavere temperatur enn beskrevet. FISH-farging kan identifisere den romlige fordelingen av mikrobiell kolonisering eller infeksjon i verten, noe som muliggjør karakterisering av vertsmikrobe og mikrobe-mikrobe-interaksjoner. En begrensning er at bare noen få konvensjonelle fluoroforer kan brukes samtidig, noe som reduserer antall forskjellige mikroorganismer som kan påvises via FISH samtidig. Dette begrenser bruken for komplekse mikrobiomstudier i C. elegans. Imidlertid bruker flerfarget rRNA-målrettet FISH prober merket med ikke-kanoniske fluoroforer som kan øke antall forskjellige mikrobielle gruppeetiketter15. En annen begrensning er at det er vanskelig å skille mellom nært beslektede arter, spesielt bakterier, som har SSU-sekvenser som er svært like. Den ekstreme sekvensforskjellen mellom mikrosporidia-arter bidrar imidlertid til å lette deres differensiering med denne protokollen (figur 3) 32,33.
Samlet sett beskriver denne FISH-protokollen en teknikk for å oppdage mikroorganismer i C. elegans. Det tillater forskere å bruke et gjennomsiktig og genetisk trekkbart modellsystem for å oppdage og kvantifisere kolonisering og infeksjon innenfor rammen av et intakt dyr, samt identifisere unik mikrobiell oppførsel eller morfologi i verten. En preprintversjon av dette manuskriptet ble lagt ut under gjennomgang34.
The authors have nothing to disclose.
Takk til Dr. Marie-Anne Félix for å gi oss ville nematode stammer. Dette arbeidet ble støttet av NSF under CAREER Grant 2143718 og California State University under en CSUPERB New Investigator Award til RJL, NIH under R01 AG052622 og R01 GM114139 til ERT, og av et American Heart Association Fellowship til VL.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |