FACS-isolering og dyrkning af fibro-adipogene forfædre og muskelstamceller fra uforstyrret og skadet museskeletmuskel
Summary
Den præcise identifikation af fibro-adipogene stamceller (FAP’er) og muskelstamceller (MuSC’er) er afgørende for at studere deres biologiske funktion under fysiologiske og patologiske forhold. Denne protokol giver retningslinjer for isolering, rensning og kultur af FAP’er og MuSC’er fra voksne musemuskler.
Abstract
Fibro-adipogene stamceller (FAP’er) er en population af skeletmuskulaturboende mesenkymale stromale celler (MSC’er), der er i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning. Sammen med muskelstamceller (MuSC’er) spiller FAP’er en kritisk rolle i muskelhomeostase, reparation og regenerering, samtidig med at de aktivt vedligeholder og ombygger den ekstracellulære matrix (ECM). Under patologiske tilstande, såsom kronisk skade og muskeldystrofier, gennemgår FAP’er afvigende aktivering og differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til fibrose og intramuskulær fedtinfiltration. FAP’er spiller således en dobbelt rolle i muskelregenerering, enten ved at opretholde MuSC-omsætning og fremme vævsreparation eller bidrage til fibrotisk ardannelse og ektopiske fedtinfiltrater, som kompromitterer skeletmuskelvævets integritet og funktion. En korrekt rensning af FAP’er og MuSC’er er en forudsætning for at forstå disse cellers biologiske rolle under fysiologiske såvel som patologiske forhold. Her beskriver vi en standardiseret metode til samtidig isolering af FAP’er og MuSC’er fra lemmermuskler hos voksne mus ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Protokollen beskriver detaljeret den mekaniske og enzymatiske dissociation af mononukleerede celler fra hele lemmer muskler og skadet tibialis anterior (TA) muskler. FAP’er og MuSC’er isoleres efterfølgende ved hjælp af en halvautomatisk cellesorterer for at opnå rene cellepopulationer. Vi beskriver desuden en optimeret metode til dyrkning af hvilende og aktiverede FAP’er og MuSC’er, enten alene eller under samkulturforhold.
Introduction
Skeletmuskulaturen er det største væv i kroppen, der tegner sig for ~ 40% af voksen menneskelig vægt, og er ansvarlig for at opretholde kropsholdning, generere bevægelse, regulere basal energimetabolisme og kropstemperatur1. Skeletmuskulatur er et meget dynamisk væv og besidder en bemærkelsesværdig evne til at tilpasse sig en række stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliske ændringer og daglige miljøfaktorer. Derudover regenererer skeletmuskulaturen som reaktion på akut skade, hvilket fører til fuldstændig restaurering af dets morfologi og funktioner2. Skeletmuskulaturens plasticitet er hovedsageligt afhængig af en population af hjemmehørende muskelstamceller (MuSC’er), også kaldet satellitceller, som er placeret mellem myofiberplasmamembranen og den basale lamina 2,3. Under normale forhold befinder MuSC’er sig i muskelnichen i en hvilende tilstand med kun få divisioner for at kompensere for cellulær omsætning og for at genopbygge stamcellepuljen4. Som reaktion på skade går MuSC’er ind i cellecyklussen, spredes og bidrager enten til dannelsen af nye muskelfibre eller vender tilbage til nichen i en selvfornyelsesproces 2,3. Ud over MuSC’er er homeostatisk vedligeholdelse og regenerering af skeletmusklen afhængig af støtte fra en population af muskelboende celler ved navn fibro-adipogene forfædre (FAP’er)5,6,7. FAP’er er mesenkymale stromale celler indlejret i muskelbindevævet og i stand til at differentiere langs fibrogen, adipogen, osteogen eller chondrogen afstamning 5,8,9,10. FAP’er yder strukturel støtte til MuSC’er, da de er en kilde til ekstracellulære matrixproteiner i muskelstamcelleniche. FAP’er fremmer også langsigtet vedligeholdelse af skeletmuskulaturen ved at udskille cytokiner og vækstfaktorer, der giver trofisk støtte til myogenese og muskelvækst 6,11. Ved akut muskelskade spredes FAP’er hurtigt for at producere en forbigående niche, der understøtter den regenererende muskels strukturelle integritet og giver et gunstigt miljø til at opretholde MuSCs spredning og differentiering på en parakrin måde5. Efterhånden som regenerering fortsætter, ryddes FAP’er fra den regenerative muskel ved apoptose, og deres antal vender gradvist tilbage til basalniveau12. Under forhold, der favoriserer kronisk muskelskade, tilsidesætter FAP’er imidlertid pro-apoptotisk signalering og akkumuleres i muskelnichen, hvor de differentierer sig til kollagenproducerende fibroblaster og adipocytter, hvilket fører til ektopiske fedtinfiltrater og fibrotisk ardannelse12,13.
På grund af deres multipotens og deres regenerative evner er FAP’er og MuSC’er blevet identificeret som potentielle mål inden for regenerativ medicin til behandling af skeletmuskelforstyrrelser. For at undersøge deres funktion og terapeutiske potentiale er det derfor vigtigt at etablere effektive og reproducerbare protokoller til isolering og kultur af FAP’er og MuSC’er.
Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) kan identificere forskellige cellepopulationer baseret på morfologiske egenskaber såsom størrelse og granularitet og tillader cellespecifik isolering baseret på brug af antistoffer rettet mod celleoverflademarkører. Hos voksne mus udtrykker MuSC’er vaskulære celleadhæsionsmolekyle 1 (VCAM-1, også kendt som CD106)14,15 og α7-Integrin 15, mens FAP’er udtrykker den blodpladeafledte vækstfaktorreceptor α (PDGFRα) og stamcelleantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A/E)5,6,9,12,16,17 . I protokollen beskrevet her blev MuSC’er identificeret som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, mens FAP’er blev identificeret som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt blev PDGFRαEGFP-mus anvendt til at isolere FAP’er som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- events18,19. Desuden sammenlignede vi overlapningen mellem det fluorescerende signal fra PDGFRα-GFP+ celler med celler identificeret ved overflademarkøren Sca1. Vores analyse viste, at alle GFP-ekspressive celler også var positive for Sca1, hvilket indikerer, at begge tilgange kan anvendes til identifikation og isolering af FAP’er. Endelig bekræftede farvning med specifikke markørantistoffer renheden af hver cellepopulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etablering af effektive og reproducerbare protokoller til identifikation og isolering af rene voksne stamcellepopulationer er det første og mest kritiske skridt i retning af at forstå deres funktion. Isolerede FAP’er og MuSC’er kan bruges til at udføre multiomics-analyse i transplantationseksperimenter som en potentiel behandling af muskelsygdomme eller kan genetisk modificeres til sygdomsmodellering i stamcelleterapi.
Protokollen, der er beskrevet her, giver standardiserede retningslinjer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) for råd om MuSC-isolation. Dette arbejde blev finansieret af NIAMS-IRP gennem NIH-tilskud AR041126 og AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
