Tradisjonelt utføres cellekultur på plane substrater som dårlig etterligner det naturlige miljøet til celler in vivo. Her beskriver vi en metode for å produsere cellekultursubstrater med fysiologisk relevante buede geometrier og mikropatternerte ekstracellulære proteiner, noe som muliggjør systematiske undersøkelser av cellulær sensing av disse ekstracellulære signalene.
Den ekstracellulære matrisen er en viktig regulator av cellefunksjon. Miljømessige signaler som eksisterer i det cellulære mikromiljøet, som ligandfordeling og vevsgeometri, har i økende grad vist seg å spille kritiske roller i styring av cellefenotype og oppførsel. Imidlertid studeres disse miljømessige signalene og deres effekter på celler ofte separat ved hjelp av in vitro-plattformer som isolerer individuelle signaler, en strategi som sterkt overforenkler den komplekse in vivo-situasjonen med flere signaler. Tekniske tilnærminger kan være spesielt nyttige for å bygge bro over dette gapet ved å utvikle eksperimentelle oppsett som fanger kompleksiteten til in vivo mikromiljøet, men beholder graden av presisjon og manipulerbarhet av in vitro-systemer .
Denne studien fremhever en tilnærming som kombinerer ultrafiolett (UV) -basert proteinmønster og litografibasert substratmikrofabrikasjon, som sammen muliggjør undersøkelse av celleadferd med høy gjennomstrømning i multicue-miljøer. Ved hjelp av maskeløs UV-fotopatterning er det mulig å lage komplekse, klebende proteinfordelinger på tredimensjonale (3D) cellekultursubstrater på sjetonger som inneholder en rekke veldefinerte geometriske signaler. Den foreslåtte teknikken kan brukes til kultursubstrater laget av forskjellige polymere materialer og kombinert med limmønstrede områder av et bredt spekter av proteiner. Med denne tilnærmingen kan enkeltceller, så vel som monolag, bli utsatt for kombinasjoner av geometriske signaler og kontaktveiledningssignaler presentert av de mønstrede substratene. Systematisk forskning ved hjelp av kombinasjoner av chipmaterialer, proteinmønstre og celletyper kan dermed gi grunnleggende innsikt i cellulære responser på multicue-miljøer.
In vivo blir celler utsatt for et bredt spekter av miljømessige signaler som kan være av mekanisk, fysisk og biokjemisk natur som stammer fra den ekstracellulære matrisen (ECM). Tallrike miljømessige signaler har blitt identifisert for å spille viktige roller i reguleringen av celleadferd, som spredning, differensiering og migrasjon 1,2,3,4,5. Et av de mest undersøkte fenomenene er kontaktveiledning, som beskriver adhesjonsmediert cellejustering langs anisotrope biokjemiske eller topografiske mønstre tilstede på det ekstracellulære substratet 6,7,8,9,10,11. Utover å styre justeringen av celler, har kontaktveiledningssignaler også vist seg å påvirke andre celleegenskaper som cellemigrasjon, organisering av intracellulære proteiner, celleform og celle skjebne 12,13,14,15. I tillegg har den geometriske arkitekturen til det 3D-cellulære miljøet også blitt anerkjent for sin regulatoriske innflytelse på celleadferd 16,17. I menneskekroppen blir celler utsatt for en rekke buede geometrier, alt fra mikroskala kollagenfibre, kapillærer og glomeruli, opp til mesoskala alveoler og arterier18,19. Interessant nok har nyere in vitro-studier vist at celler kan fornemme og reagere på slike fysiske signaler, fra nano- til mesoskala 20,21,22,23.
Til dags dato har de fleste studier som undersøker cellerespons på miljøsignaler i stor grad blitt utført ved hjelp av eksperimentelle oppsett som isolerer enkeltsignaler. Selv om denne tilnærmingen har tillatt enorme fremskritt i å forstå de grunnleggende mekanismene bak cellulær sensing av miljømessige signaler, rekapitulerer den dårlig det in vivo miljøet som samtidig presenterer flere signaler. For å bygge bro over dette gapet er det nyttig å utvikle kulturplattformer der flere miljøsignaler kan kontrolleres uavhengig og samtidig. Dette konseptet har fått økende trekkraft i det siste24,25, med studier som kombinerer matrisestivhet og ligandtetthet 26,27,28,29, substratstivhet og porøsitet30, substratstivhet og 3D mikronichevolum 31, overflatetopografi ogkontaktveiledningssignaler 32,33,34 , og nanoskala kontaktveiledningssignaler med mesoskala krumningsveiledning23. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å kombinere kontaktveiledningssignaler med en rekke 3D-geometrier på en kontrollert og høy gjennomstrømningsmåte.
Denne forskningsprotokollen adresserer denne utfordringen og introduserer en metode for å lage cellekultursubstrater med en kontrollert kombinasjon av mønstrede klebende områder av ECM-proteiner (kontaktveiledningssignaler) og substratkrumning (geometriske signaler). Denne tilnærmingen tillater disseksjon av cellerespons i et biomimetisk multicue-miljø på en systematisk og høy gjennomstrømnings måte. Kunnskapen som er oppnådd kan hjelpe til med videre forståelse av celleadferd i komplekse miljøer og kan brukes til å designe lærerike materialer med egenskaper som styrer celleresponser til et ønsket resultat.
Fotopatterning av 3D-proteiner
Opprettelse av klebende områder av ECM-proteiner (kontaktveiledningssignaler) på cellekulturmaterialer kan oppnås ved hjelp av en rekke teknikker, for eksempel ved dyp ultrafiolett (dyp UV) mønster eller mikrokontaktutskrift35,36. Deep-UV-mønster bruker UV-lys som projiseres gjennom en maske på et polymert materiale for å nedbryte passiveringspolymerer på bestemte steder på cellekultursubstratet. Det mønstrede substratet inkuberes deretter med en ligand av interesse, noe som resulterer i klebende områder som støtter cellefeste og kultur på forhåndsdefinerte steder 12,37,38. En alternativ måte å introdusere proteinmønstre på er ved hjelp av mikrokontakttrykk, hvor elastomere frimerker som inneholder ønsket form er belagt med et valgfritt protein og presses på et cellekultursubstrat, og overfører dermed proteinbelegget som celler kan feste seg til 35,37,39,40 . Dessverre, siden begge teknikkene er avhengige av maskeforberedelse og myke litografimetoder, er eksperimentene tidkrevende og arbeidskrevende, så vel som begrensede når det gjelder mønsterfleksibilitet. I tillegg er både dyp UV-mønster og mikrokontaktutskrift mest egnet for plane materialer og er teknisk vanskelig, om ikke umulig, for mønsterligander i et 3D-miljø.
For å forbedre disse konvensjonelle metodene kombinerte Waterkotte et al. maskeløs litografi, kjemisk dampavsetning og termoforming for å generere mikropatterned 3D polymere substrater41. Imidlertid er denne teknikken avhengig av bruk av termoformbare polymerfilmer og tilbyr lav proteinmønsteroppløsning (7,5 μm), mens celler har blitt rapportert å reagere på geometriske proteinmønstre så små som 0,1 μm 2,42. Sevcik og medarbeidere beskrev en annen lovende metode for nanopattern ECM-ligander på substrater som inneholder nano- og mikrometer-topografi43. Ved hjelp av mikrokontakttrykk ble ECM-proteiner overført fra polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker til et termoresponsivt poly (N-isopropylacrylamid) (pNIPAM) substrat. Deretter tillot den termoresponsive egenskapen til pNIPAM-nettverket dem å overføre det todimensjonale (2D) proteinmønsteret til et topografisk PDMS-substrat (10-100 μm dype spor), og dermed kontrollere lokaliseringen av adhesjonssteder på topografiske egenskaper. Imidlertid kan ikke alle mulige mikrotopografier mønstres siden reduserte fuktbarhetsproblemer gjør det vanskeligere å mønstre dypere topografiske substrater. Grøfter med et dybde-til-bredde-sideforhold på 2,4 har blitt rapportert å være den ultimate grensen for vellykket overføring av mønsteret til det topografiske substratet43. I tillegg er fleksibiliteten til varierende mønstre og oppløsningen til de genererte mønstrene dårlig på grunn av kravet til mikrokontaktutskrift.
Denne artikkelen beskriver en metode som overvinner de ovennevnte flaskehalsene og tilbyr en fleksibel og høy gjennomstrømningsmetode for å lage multikusubstrater som kan brukes til cellekultur (se figur 1). Fysiologisk relevante geometrier (sylindere, kupler, ellipser og sadeloverflater) med krumninger fra ĸ = 1/2500 til ĸ = 1/125 μm-1 er forhåndsdesignet og mikrofabrikkert i PDMS-brikker. Deretter opprettes kontaktveiledningssignaler på toppen av 3D-geometriene ved hjelp av en rekke digitale mønsterdesign ved å bruke en fotopatteringsteknikk med en oppløsning så liten som 1,5 μm44. For dette formål blir PDMS-sjetongene i utgangspunktet passivert for å forhindre at celler og proteiner fester seg; dette passiveringslaget kan deretter fjernes ved kombinasjon av fotoinitiatoren 4-benzoylbenzyl-trimetylammoniumklorid (PLPP) og UV-lyseksponering45. En digital maske er designet for å spesifisere plasseringen av UV-eksponering, og dermed området der passiveringslaget fjernes. Proteiner kan deretter feste seg til disse områdene, noe som muliggjør cellefeste. Siden mønsteret utføres ved hjelp av en digital (i stedet for en fysisk) maske, kan en rekke mønstre opprettes raskt uten problemer og kostnader forbundet med å designe og produsere flere fotomasker. I tillegg kan et mangfoldig utvalg av ECM-proteiner (f.eks. Kollagen type I, gelatin og fibronektin) mønstres på substratet. Selv om denne protokollen utføres ved hjelp av cellekulturbrikker laget av PDMS, kan prinsippet brukes på ethvert annet materiale av interesse46.
I dag studeres celleadferd ofte på flatkultursubstrater som mangler kompleksiteten til det opprinnelige cellemikromiljøet. 3D-miljøer som stillaser og hydrogeler brukes som et alternativ. Selv om disse cellekulturmiljøene forbedrer in vivo-relevansen, er både systematiske studier av celleadferd og muligheten for avlesningsmetoder fortsatt utfordrende. For systematisk å undersøke celleadferd på representative kultursubstrater, er det nødvendig med konsistente multikusubstrater som muliggjør mikroskopisk avlesning. Derfor beskriver vi i denne protokollen en metode for å lage multikuecellekultursubstrater med fysiologisk relevante geometrier og mønstrede ECM-proteiner. Hovedutfordringen med å kombinere miljømessige signaler som vevsgeometri og kontaktveiledningssignaler på in vitro-plattformer er i stor grad av teknologisk karakter. Konvensjonelle metoder for å anvende kontaktveiledningssignaler (f.eks. myk litografi, dyp UV-mønster og mikrokontaktutskrift35,36) til cellekulturmaterialer er optimalisert for plane underlag. Behovet for 3D-cellekulturmaterialer kombinert med kontaktveiledningssignaler fremhevet flere teknologiske utfordringer, for eksempel dårlig mønsterjustering, oppløsning og fleksibilitet. For å overvinne disse utfordringene kan en høy gjennomstrømning, maskeløs, lysbasert mønstermetode brukes45,49. Her muliggjør et optisk mikroskop presis mønsterjustering og en oppløsning i størrelsesorden mikrometer (se figur 6). Videre gjør bruken av en digital maske det mulig for forskere å studere celleadferd på et bredt spekter av mønstre uten å måtte fremstille arbeidsintensive fysiske masker.
UV-fotopatterningsmetoden kan brukes i kombinasjon med en rekke 3D-geometrier (f.eks. sylindere, seter, kupler, groper) produsert av en rekke materialer48. 3D-cellekultursubstratene som ble brukt i denne studien er laget av PDMS; andre materialer kan imidlertid også brukes. Dette kan kreve forskjellige trinn for å produsere det endelige cellekultursubstratet som inneholder funksjonene av interesse. Siden celler har vist seg å være følsomme for overflateruhet av cellekulturmaterialer, er det viktig å lage cellekulturbrikkene med en jevn overflate slik at de observerte cellenes respons fullt ut kan tilskrives 3D-geometrien og kontaktveiledningssignalene50,51. Målemetoder som optisk profilometri, scanning elektronmikroskopi eller atomkraftmikroskopi kan brukes til å måle overflateruhet. Etter fabrikasjon av cellekulturmaterialet kan man velge en mønstermetode basert på ett eller flere fokalplan avhengig av de spesifikke dimensjonene til funksjonen av interesse (se figur 3). Vanligvis brukes et enkelt fokalplan til å mønstre et område innenfor et Z-område på omtrent 50 μm. Mønsteroppløsningen ble vist å være konsistent ved bruk av denne tommelfingerregelen (se figur 6). En ulempe med denne metoden er imidlertid den økte mønstertiden med innføring av flere fokale plan og mønstre. I vår hånd, ved hjelp av flere fokale plan, har 3D geometriske egenskaper opp til 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) blitt vellykket mønstret med høy mønsterkvalitet.
I tillegg er det viktig å nevne at høyden (Z-aksen) av geometriske egenskaper som kan brukes i kombinasjon med denne protokollen er begrenset. Siden både UV-fotopatterning og mange cellulære avlesninger er avhengige av et mikroskopioppsett, bestemmer arbeidsavstanden til målene maksimal høyde på en funksjon. I vår hånd kan geometrier over en høyde på 300 μm fortsatt uv-fotopatterned, og avlesninger har blitt utført ved hjelp av et konfokalt mikroskop med 40x mål. Dermed er mekanobiologisk forskning som spenner fra intracellulære til cellulære og vevsskalaer mulig ved bruk av den beskrevne protokollen.
En annen faktor som må tas i betraktning er risikoen for at prøvene tørker ut under eller etter UV-fotopatterning49. Dette er spesielt relevant ved bruk av 3D-geometrier, da konveksiteter ofte eksponeres utenfor cellekulturmaterialer. Som vist i figur 4, kan dette føre til ujevne mønstre med proteinaggregater som dannes på toppen av funksjonen av interesse. Vaskingen av cellekulturbrikkene etter proteininkubasjon og under cellekultur er avgjørende for riktig belegg av 3D-geometrier. Derfor anbefales det å alltid legge små mengder av en arbeidsløsning (PBS, PLPP, proteinoppløsning, cellekulturmedium) på toppen av cellekulturbrikken.
Så langt har flere proteinbelegg (fibronektin, kollagen type I og IV, gelatin, FNC) og celletyper (humane benmargsstromalceller, humane myofibroblaster, humane endotelceller, humane keratocytter og dermale fibroblaster) blitt brukt i kombinasjon med den beskrevne fotopatterningsmetoden på strukturerte cellekulturmaterialer. Som vist i en tidligere studie48, er optimalisering av proteininkubasjonsparametere nøkkelen til systematisk undersøkelse i nye celletyper. Derfor, før du utfører et nytt eksperiment med nye proteiner eller celler, anbefales det å teste en rekke proteinkonsentrasjoner, inkubasjonstemperaturer og inkubasjonstider. Ved å sammenligne cellemorfologi etter første adhesjon på homogene, mønstrede flate områder med cellemorfologi under “normale” cellekulturforhold, kan et optimalisert sett med eksperimentelle parametere oppnås. I tillegg kan hver celletype kreve forskjellig tid etter såing for å vise en gjenkjennelig adhesjonsmorfologi på et bestemt multicue-miljø (se figur 5). For dette formål er det avgjørende å optimalisere tiden som kreves per celletype for å presentere kontakthendelser på det mønstrede området under vasken i trinn 8.4. For eksempel observerte vi at på linjemønstre viser humane keratocytter langstrakte morfologier innen de første 30 minuttene etter sådd, mens endotelceller og dermale fibroblaster krever flere timer før de viser en endring i adhesjonsmorfologi. De eksperimentelle parametrene som kreves for proteininkubasjon (trinn 7) og cellesåing (trinn 8) kan dermed være avhengig av hvilket protein og celletype som velges.
Den presenterte tilnærmingen til å bruke kontaktveiledningssignaler på 3D-geometrier kan hjelpe til med å skape en dypere forståelse av celleadferd i komplekse multicue-miljøer. Dette kan omfatte undersøkelser av intracellulære komponenter, som fokale adhesjoner og kjerner, og kan også involvere eksperimenter utført på større celle- eller vevsskala ved hjelp av den foreslåtte metoden. Til slutt forventes det at kunnskapen som er oppnådd, kan brukes i utformingen av vevstekniske applikasjoner, hvor komplekse cellulære miljøer er designet for å styre celleadferd mot et ønsket resultat.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) for å gi humane primære keratocytter. Dette arbeidet har blitt støttet av Chemelot InSciTe (prosjekt BM3.02); Det europeiske forskningsrådet (stipend 851960); og Departementet for utdanning, kultur og vitenskap for gravitasjonsprogrammet 024.003.013 “Material Driven Regeneration”. Forfatterne takker Alvéole for korrespondanse, hjelp og feilsøking.
Anti-vinculin antibody, mouse monoclonal IgG1 | Sigma | V9131 | Dilution: 1/600 |
Bovine Serum albumin, Fraction V | Roche | 10735086001 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 41966029 | |
DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x) | Gibco | 10565018 | |
DMi8 epifluorescent microscope | Leica Microsystems | ||
Ethanol | Biosolve | 0005250210BS | |
Fetal Bovine Serum | Serana | 758093 | |
Fiji/ImageJ, version v1.53k | www.imageJ.nih.gov | ||
Fluorescent highlighter | Stabilo | 4006381333627 | |
Fluorescin-labeled gelatin | Invitrogen | G13187 | Concentration: 0.01% |
Formaldehyde solution | Merck | F8775 | |
Glass coverslips 24 x 60 mm, #1 | VWR | 631-1575 | |
Glass coverslips, ø = 32 mm, #1 | Menzel-Gläser | ||
HCX PL fluotar L 20X/0.40na microscope objective | Leica | 11506242 | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Human dermal fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
Human primary keratocytes | MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine | ||
Illustrator, Version 26.0.1 | Adobe | ||
Laboratory oven | Carbolite | ||
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225 | Leica Microsystems | ||
Leonardo software, version 4.16 | Alvéole | ||
Micro-manager, version 1.4.23 | Open imaging | ||
Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | mounting medium |
mPEG-succinimidyl valerate MW 5,000 Da | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | Concentration: 50 mg/mL |
Negative glass mold | FEMTOprint | ||
NucBlue Live Readyprobes Reagent (Hoechst 33342) | Invitrogen | R37605 | 2 drops/mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140163 | |
Petri dish (ø=100 mm) | Greiner Bio-one | 664160 | |
Phalloidin Atto 647N | Sigma | 65906 | Dilution: 1/250 |
Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | |
Plasma asher | Emitech | K1050X | |
PLPP (photoinitiator) | Alvéole | ||
Poly-L-lysine, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | P4707 | Concentration: 0.01% |
PRIMO | Alvéole | ||
Rhodamine-labeled fibronectin | Cytoskeletn, Inc. | FNR01 | Concentration: 10 µg/mL |
Secondary antibody with Alexa 488, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21121 | Dilution: 1/300 |
Secondary antibody with Alexa 555, Goat anti-mouse IgG1 (H) | Molecular Probes | A21127 | Dilution: 1/300 |
Spin coater | Leurell Technologies Corporation | model WS-650MZ-23NPPB | |
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 1673921 | |
TCS SP8X confocal microscope | Leica Microsystems | ||
tridecafluoro(1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane | ABCR | AB111444 | |
TrypLE Express Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 |