בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לחילוץ שלפוחיות חוץ-תאיות מהדם ההיקפי ומרקמות מוצקות עם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) במחזור הדם ושוכנות רקמות מייצגות מטרות מבטיחות כסמנים ביולוגיים תרנוסטיים חדשים, והן מתגלות כשחקנים חשובים בשמירה על הומאוסטזיס אורגניזם והתקדמות של קשת רחבה של מחלות. בעוד המחקר הנוכחי מתמקד באפיון של אקסוזומים אנדוגניים עם מקור אנדוזומלי, microvesicles blebbing מן קרום פלזמה זכו לתשומת לב גוברת בבריאות וחולי, אשר מתאפיינים על ידי שפע של מולקולות פני השטח לשחזר את חתימת הממברנה של תאי הורה. כאן מוצג הליך הניתן לשחזור המבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מהפלזמה ומרקמות מוצקות, כגון העצם. הפרוטוקול מתאר גם פרופיל עוקב של אנטיגנים על פני השטח ומטעני חלבונים של כלי רכב חשמליים, אשר ניתן לעקוב אחר נגזרותיהם ומזוהים עם רכיבים הקשורים לתפקוד פוטנציאלי. שיטה זו תהיה שימושית לניתוח קורלטיבי, פונקציונלי ומכניסטי של כלי רכב חשמליים במחקרים ביולוגיים, פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Introduction
שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) הוצעו כדי להגדיר מבנים חוץ-תאיים מוקפים דו-שכבתיים של שומנים בתאים1, הממלאים תפקידים חשובים באירועים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים2. ניתן לחלק באופן כללי כלי רכב חשמליים המשוחררים על ידי תאים בריאים לשתי קטגוריות עיקריות: אקסוזומים (או כלי רכב חשמליים קטנים) הנוצרים באמצעות מסלול סחר אנדוציטי תוך-תאי3 ומיקרו-שלפוחיות (או EV גדולות) המתפתחות על ידי הניצנים החיצוניים של קרום הפלזמה של תא4. בעוד שמחקרים רבים מתמקדים בתפקוד של כלי רכב חשמליים שנאספו מתאים בתרבית במבחנה5, כלי רכב חשמליים שמקורם במחזור הדם או ברקמות מורכבים והטרוגניים יותר, שיש להם יתרון בכך שהם משקפים את המצב האמיתי של האורגניזם in vivo6. יתר על כן, כמעט כל סוגי הרקמות יכולים לייצר EVs in vivo , ורכבים חשמליים אלה יכולים לפעול כשליחים בתוך הרקמה או להיות מועברים על ידי נוזלי גוף שונים, במיוחד הדם ההיקפי, כדי להקל על תקשורת מערכתית7. כלי רכב חשמליים במחזור הדם וברקמות הם גם מטרות לאבחון מחלות ולטיפול בהן8.
בעוד האקסוזומים נחקרו באופן אינטנסיבי בשנים האחרונות, למיקרו-שלפוחיות יש גם תפקידים ביולוגיים חשובים, אותם ניתן לחלץ בקלות ללא אולטרה-צנטריפוגה, ובכך לקדם מחקר בסיסי וקליני9. יש לציין כי סוגיה קריטית בנוגע לרכבים חשמליים המבודדים ממחזור הדם ומהרקמות היא שהם נגזרים מסוגי תאים שונים10. מאחר שמיקרו-שלפוחיות מובלות מממברנת הפלזמה ומוצגות על ידי שפע של מולקולות פני התא9, שימוש בסמנים של קרום תא האב כדי לזהות את המקור התאי של כלי רכב חשמליים אלה הוא אפשרי. באופן ספציפי, ניתן ליישם את טכניקת ציטומטריית הזרימה (FC) כדי לזהות סמני ממברנה. יתר על כן, החוקרים יכולים לבודד את כלי הרכב החשמליים ולבצע ניתוחים נוספים המבוססים על המטענים הפונקציונליים.
הפרוטוקול הנוכחי מספק הליך יסודי לחילוץ ואפיון כלי רכב חשמליים מדגימות in vivo. כלי הרכב החשמליים מבודדים באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית, ואפיון כלי הרכב החשמליים כולל זיהוי מורפולוגי באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מקור באמצעות FC וניתוח מטעני חלבונים באמצעות כתם מערבי. פלסמת הדם והעצם המקסימלית של עכברים משמשים כנציגים. חוקרים יכולים להתייחס לפרוטוקול זה עבור כלי רכב חשמליים ממקורות אחרים ולבצע שינויים מתאימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאשר בוחנים את התכונות, הגורל והתפקוד של כלי רכב חשמליים, חיוני לבודד כלי רכב חשמליים עם תפוקה גבוהה וזיהום נמוך. קיימות שיטות שונות לחילוץ כלי רכב חשמליים, כגון צנטריפוגת שיפוע צפיפות (DGC), כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) ומבחני לכידת חיסון 4,20. כאן נעשה שימו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32000974, 81870796, 82170988 ו- 81930025) והקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (2019M663986 ו- BX20190380). אנו אסירי תודה על הסיוע של המרכז הלאומי להדגמת הוראה ניסויית לרפואה בסיסית (AMFU).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
