Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Summary

Le présent protocole décrit une méthode pour extraire les vésicules extracellulaires du sang périphérique et des tissus solides avec profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons de protéines.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) circulantes et résidentes dans les tissus représentent des cibles prometteuses en tant que nouveaux biomarqueurs théranostiques, et elles apparaissent comme des acteurs importants dans le maintien de l’homéostasie de l’organisme et la progression d’un large éventail de maladies. Alors que les recherches actuelles se concentrent sur la caractérisation des exosomes endogènes d’origine endosomale, les microvésicules qui s’échappent de la membrane plasmique ont attiré de plus en plus d’attention dans les domaines de la santé et de la maladie, qui se caractérisent par une abondance de molécules de surface récapitulant la signature membranaire des cellules mères. Ici, une procédure reproductible est présentée basée sur la centrifugation différentielle pour extraire et caractériser les VE du plasma et des tissus solides, tels que l’os. Le protocole décrit en outre le profilage ultérieur des antigènes de surface et des cargaisons protéiques des véhicules électriques, qui sont donc traçables pour leurs dérivations et identifiés avec des composants liés à la fonction potentielle. Cette méthode sera utile pour l’analyse corrélative, fonctionnelle et mécaniste des VE dans les études biologiques, physiologiques et pathologiques.

Introduction

Des vésicules extracellulaires (VE) ont été proposées pour définir les structures extracellulaires enfermées dans la bicouche lipidique^{libérée par} les cellules 1, qui jouent un rôle important dans divers événements physiologiques et pathologiques². Les VE libérés par les cellules saines peuvent être divisés en deux catégories principales, à savoir les exosomes (ou petits VE) formés par une voie de trafic endocytaire intracellulaire³ et les microvésicules (ou gros VE) développées par le bourgeonnement vers l’extérieur de la membrane plasmique de la cellule⁴. Alors que de nombreuses études portent sur la fonction des VE prélevés in vitro^sur des cellules cultivées 5, les VE issus de la circulation ou des tissus sont plus complexes et hétérogènes, ce qui a l’avantage de refléter l’état réel de l’organisme in vivo6^. En outre, presque tous les types de tissus peuvent produire des VE in vivo , et ces VE peuvent agir comme messagers dans le tissu ou être transférés par divers fluides corporels, en particulier le sang périphérique, pour faciliter la communication systémique⁷. Les VE dans la circulation et les tissus sont également des cibles pour le diagnostic et le traitement des maladies⁸.

Alors que les exosomes ont été intensivement étudiés ces dernières années, les microvésicules ont également des fonctions biologiques importantes, qui peuvent être facilement extraites sans ultracentrifugation, favorisant ainsi la recherche fondamentale et clinique⁹. Notamment, un problème critique concernant les VE isolés de la circulation et des tissus est qu’ils sont dérivés de différents types de cellules¹⁰. Étant donné que les microvésicules sont soufflées à partir de la membrane plasmique et caractérisées par une abondance de molécules de surface cellulaire⁹, il est possible d’utiliser des marqueurs membranaires cellulaires parents pour identifier l’origine cellulaire de ces VE. Plus précisément, la technique de cytométrie en flux (FC) peut être appliquée pour détecter les marqueurs membranaires. De plus, les chercheurs peuvent isoler les véhicules électriques et effectuer d’autres analyses en fonction des cargaisons fonctionnelles.

Le présent protocole prévoit une procédure rigoureuse pour extraire et caractériser les VE à partir d’échantillons in vivo. Les VE sont isolés par centrifugation différentielle, et la caractérisation des VE comprend l’identification morphologique par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et la microscopie électronique à transmission (MET), l’analyse d’origine par FC et l’analyse de la cargaison de protéines par transfert Western. Le plasma sanguin et l’os maxillaire des souris sont utilisés comme représentants. Les chercheurs peuvent se référer à ce protocole pour les VE provenant d’autres sources et apporter les modifications correspondantes.

Protocol

Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la quatrième Université médicale militaire et aux directives ARRIVE. Pour la présente étude, des souris C57Bl/6 âgées de 8 semaines (aucune préférence pour les femelles ou les mâles) ont été utilisées. Les étapes de l’isolement des VE plasmatiques et tissulaires sont illustrées à la figure 1. Le plasma est pris comme…

Representative Results

Selon le flux de travail expérimental, les VE peuvent être extraits du sang périphérique et des tissus solides (Figure 1). L’os maxillaire d’une souris âgée de 8 semaines est d’environ 0,1 ± 0,05 g, et environ 300 μL de plasma peuvent être prélevés sur la souris. En suivant les étapes du protocole, 0,3 mg et 3 μg de VE peuvent être collectés, respectivement. Comme analysé par TEM et NTA, les caractéristiques morphologiques typiques des VE sont des vésicules membranair…

Discussion

Lors de l’étude des caractéristiques, du devenir et de la fonction des véhicules électriques, il est crucial d’isoler les véhicules électriques à haut rendement et à faible contamination. Diverses méthodes existent pour extraire les VE, telles que la centrifugation par gradient de densité (DGC), la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et les tests d’immunocapture ^4,20. Ici, l’une des méthodes les plus couramment utilisées, la centrifu…

Materials

4% paraformaldehyde	Biosharp	143174	Transmission electron microscope
Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody	Yeason	34306ES60	Flow cytometry
Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody	Invitrogen	A11008	Flow cytometry
Anti-CD18 antibody	Abcam	ab131044	Flow cytometry
Anti-CD81 antibody	Abcam	ab109201	Western blot
anti-CD9 antibody	Huabio	ET1601-9	Western blot
Anti-Mitofilin antibody	Abcam	ab110329	Western blot
APOA1 Rabbit pAb	Abclone	A14211	Western blot
BCA protein assay kit	TIANGEN	PA115	Western blot
BLUeye Prestained Protein Ladder	Sigma-Aldrich	94964-500UL	Western blot
Bovine serum albumin	MP Biomedical	218072801	Western blot
Caveolin-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53564	Western blot
CellMask Orange plasma membrane stain	Invitrogen	C10045	Flow cytometry
Chemiluminescence	Amersham Biosciences	N/A	Western blot
Curved operating scissor	JZ Surgical Instrument	J21040	EV isolation
Electronic balance	Zhi Ke	ZK-DST	EV isolation
Epoch spectrophotometer	BioTek	N/A	Western blot
Eppendorf tubes	Eppendorf	3810X	EV isolation
Flotillin-1 antibody	PTM BIO	PTM-5369	Western blot
Gel imaging system	Tanon	4600	Western blot
Golgin84	Novus	nbp1-83352	Western blot
Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh	Polysciences	24915	Transmission electron microscope
Heparin Solution	StemCell	7980	EV isolation
Liberase Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001	EV isolation
Microscopic tweezer	JZ Surgical Instrument	JD1020	EV isolation
NovoCyte flow cytometer	ACEA	N/A	Flow cytometry
Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells	Epizyme	LK206	Western blot
OSCAR(D-19) antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-34235	Flow cytometry
PBS (2x)	ZHHC	PW013	Western blot
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	57-33-0	Anesthetization
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jacson	115-035-003	Western blot
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jacson	111-035-003	Western blot
Phosphotungstic acid	RHAWN	12501-23-4	Transmission electron microscope
PKM2(d78a4) xp rabbit  mab	Cell Signaling	4053t	Western blot
Polyethylene (PE) film	Xiang yi	200150055	Transmission electron microscope
Polyvinylidene fluoride membranes	Roche	3010040001	Western blot
Protease inhibitors	Roche	4693132001	Western blot
Recombinant anti-PGD antibody	Abcam	ab129199	Western blot
RIPA lysis buffer	Beyotime	P0013	Western blot
SDS-PAGE loading buffer (5x)	Cwbio	CW0027S	Western blot
Size beads	Invitrogen	F13839	Flow cytometry
Tabletop High-Speed Micro Centrifuges	Hitachi	CT15E	EV isolation
Transmission electron microscope	HITACHI	H-7650	Transmission electron microscope
Tween-20	MP Biomedicals	19472	Western blot
Vortex Mixer Genie	Scientific Industries	SI0425	EV isolation
ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120	Particle Metrix	N/A	Nanoparticle tracking analysis
α-Actinin-4 Rabbit mAb	Abclone	A3379	Western blot
β-actin	Cwbio	CW0096M	Western blot