يفصل هذا البروتوكول طريقة لتشريح مستودعات الفئران الدهنية وعزل وهضم الشرايين المعنية لتحرير ومن ثم تحديد مجموعة الخلايا البطانية. الخلايا المعزولة حديثا المستخدمة في تطبيقات المصب ستعزز فهم بيولوجيا الخلايا الوعائية وآليات خلل الأوعية الدموية.
تلعب الخلايا البطانية الوعائية المبطنة لجدار نظام الأوعية الدموية أدوارا مهمة في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك تنظيم نغمة الأوعية الدموية ، ووظائف الحاجز ، وتكوين الأوعية. يعد خلل الخلايا البطانية مؤشرا مميزا ومحركا رئيسيا لتطور أمراض القلب والأوعية الدموية الحادة ، ومع ذلك لا تزال الآليات الأساسية غير مفهومة بشكل جيد. إن القدرة على عزل وإجراء التحليلات على الخلايا البطانية من مختلف أسرة الأوعية الدموية في شكلها الأصلي ستعطي نظرة ثاقبة على عمليات أمراض القلب والأوعية الدموية. يقدم هذا البروتوكول إجراء تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد والمساريقي للفئران ، يليه عزل الأوعية الدموية الشريانية لكل منها. ثم يتم هضم الشرايين المعزولة باستخدام مزيج محدد من الإنزيمات الهضمية التي تركز على تحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة وظيفيا. يتم تقييم الأنسجة المهضومة عن طريق تحليل التدفق الخلوي باستخدام خلايا CD31 + / CD45 − كعلامات لتحديد الخلايا البطانية الإيجابية. يمكن فرز الخلايا لإجراء فحوصات وظيفية فورية في المصب أو استخدامها لإنشاء خطوط خلايا أولية. ستوفر تقنية عزل وهضم الشرايين من أسرة الأوعية الدموية المختلفة خيارات للباحثين لتقييم الخلايا الوعائية المعزولة حديثا من الشرايين ذات الأهمية والسماح لهم بإجراء مجموعة واسعة من الاختبارات الوظيفية على أنواع معينة من الخلايا.
الخلايا البطانية معروفة جيدا لأدوارها الهامة في مجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية ، بما في ذلك وظائف الحاجز ، وتكوين الأوعية الدموية ، وتنظيم نغمة الأوعية الدموية 1,2. على الرغم من أن خلل الخلايا البطانية موثق جيدا في تعزيز تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكري وما إلى ذلك ، إلا أن الآليات الأساسية التي تؤدي إلى الخلل البطاني لا تزال غير مفهومة بشكل جيد ومن المحتمل أن تختلف بين أسرة الأوعية الدموية المتميزة2،3،4. إن الجهود المبذولة لكشف هذه الآليات المرضية لخلل الخلايا البطانية تواجه تحديا يتمثل في محدودية الوصول إلى مجموعة نقية من الخلايا البطانية من الأنسجة و / أو التغيرات المظهرية للخلايا البطانية في الثقافة 5,6. لذلك ، فإن القدرة على عزل وإجراء تحليلات على الخلايا البطانية من مختلف أسرة الأوعية الدموية في شكلها الأصلي ستعطي نظرة ثاقبة على عمليات أمراض القلب والأوعية الدموية.
يقدم هذا البروتوكول إجراء تشريح الأنسجة الدهنية تحت الجلد والمساريقي من الفئران ، يليه عزل الأوعية الدموية الشريانية الخاصة بكل منها. يتم تحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة وظيفيا التي تبطن جدران الشرايين باستخدام مزيج محدد من الإنزيمات. تم إيلاء عناية خاصة لتحسين ظروف بروتوكول الهضم للحصول على عائد كاف من الخلايا البطانية من <1 ملغ من الأنسجة الأولية مع الحفاظ على العلامات الجزيئية الحيوية سليمة للتحليل. يتم تحديد الخلايا البطانية المعزولة بعد ذلك باستخدام قياس التدفق الخلوي. يستخدم وجود CD31 (PECAM) لتحديد الخلايا البطانية في المقام الأول. بسبب التعبير عن CD31 في أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك العديد من أصل المكونة للدم التي تعبر أيضا عن CD45 ، تم تعزيز نقاء الخلايا البطانية المعزولة من خلال استبعاد الخلايا التي تعبر عن كل من CD31 و CD45 5,6,7,8. علاوة على ذلك ، اعتمادا على سؤال البحث والتطبيقات النهائية التي سيتم استخدامها ، يجب على الباحثين النظر في اختيار مجموعة واسعة من علامات الاختيار الإيجابية والسلبية لتحسين نقاء مجموعة الخلايا ذات الاهتمام.
على الرغم من أن تقنية تشريح وعزل شرايين مستودع الدهون قد استخدمت في المنشورات السابقة9،10،11،12،13 ، إلا أنه لم يتم بعد تقديم بروتوكول مفصل يصف عزل الشرايين المدمجة. إن إظهار تقنية عزل وهضم الشرايين من أسرة وعائية مختلفة من نوع معين ذي أهمية سيوفر خيارات للباحثين لتقييم الخلايا الوعائية المعزولة حديثا من الشرايين ذات الأهمية والسماح لهم بإجراء مجموعة واسعة من الاختبارات الوظيفية على أنواع محددة من الخلايا. قد تشمل الاختبارات على سبيل المثال لا الحصر قياس التدفق الخلوي لفرز الخلايا والتعبير عن بروتين الغشاء 5,8 ، والفيزيولوجيا الكهربية لنشاط القناة الأيونية9 ، والتنميط الجزيئي (البروتينات / التحليلات الجينومية ، وما إلى ذلك) 14,15 ، وتوليد خطوط الخلايا الأولية لفحص المخدرات في المختبر16,17.
الخلل البطاني هو مقدمة لحالات مرضية حادة ، من المحتمل أن يؤدي إلى تطور تصلب الشرايين وارتفاع ضغط الدم والسكتة الدماغية 3,23. في حين أن الآليات المحددة الكامنة وراء الخلل البطاني في حالة مرضية معينة كثيرة ، فمن المرجح أن تتأثر الأسرة الوعائية المتميزة بشكل تفاضلي بالحالات المرضية 4,24. علاوة على ذلك ، فإن عوامل الخطر القلبية الوعائية المختلفة (مثل السمنة وارتفاع ضغط الدم وخلل شحوم الدم والتدخين والسكري) تحفز الخلل الوظيفي من خلال مجموعة متنوعة من الآليات المتميزة23,25. لذلك ، من الأهمية بمكان عزل مجموعات الخلايا البطانية عن النماذج الحيوانية الراسخة للمرض أو الأنسجة البشرية التي يمكن الوصول إليها وإجراء اختبارات على الخلايا التي تمت إزالتها على الفور من البيئة في الجسم الحي. تتمتع الخلايا المعزولة بهذه الطريقة بميزة فريدة على دراسة الخلايا في الثقافة من حيث أنها خالية من التغيرات الظاهرية التي تسببها الثقافة 5,6. علاوة على ذلك ، بما في ذلك مجموعة الخلايا البطانية غير المتجانسة ، كما لوحظ في الجسم الحي 26,27 (والتي يمكن فصلها بشكل أكبر باستخدام فرز الخلايا بمساعدة التدفق) ، من كائن حي يبلغ بشكل أفضل البيئة في الجسم الحي. وأخيرا، تنطبق هذه الطريقة على التحقيق في العديد من النماذج الحيوانية والأنسجة البشرية المحتملة، ويمكن استخدامها لتوليد خطوط زراعة الخلايا الأولية، إذا كانت هناك ما يبرر مثل هذه الحاجة.
الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول ، والخطوة التي ستحتاج إلى تعديل أكبر لأسرة الأوعية الدموية المختلفة أو أنواع الخلايا غير المعروضة هنا ، هي هضم الأنسجة الوعائية. يجب تحسين هذه الخطوة لصحة الخلية دون تقليل إنتاجية الخلايا. تعتبر الإنزيمات المحددة المستخدمة ومدة الهضم ضرورية لتحسين صحة الخلايا والعائد لتكون قادرة على إجراء الفحوصات النهائية بشكل كاف. لتحديد التعبير الغشائي ل CD36 ، كما تم اكتشافه بواسطة قياس التدفق الخلوي في الخلايا البطانية تحت الجلد والمساريقي (الشكل 4) ، تم تطوير نسخة معدلة من بروتوكول الهضم المصمم أصلا للفيزيولوجيا الكهربيةالمشبك بالتصحيح 28 . وشمل ذلك تمديد وقت هضم الكولاجيناز I إلى 30 دقيقة لزيادة غلة الخلايا لتلبية متطلبات قياس التدفق الخلوي بشكل أفضل مقابل ما هو مطلوب لدراسات المشبك التصحيحي. وبما أن هذا التعديل قد يؤثر على صحة الخلية إلى حد ما، فقد تم استخدام بقعة بقاء الخلية في تحليلات قياس التدفق الخلوي لضمان تقييم الخلايا البطانية القابلة للحياة فقط بعد هذا البروتوكول (الشكل 3). يوصى بأن تتضمن الدراسات التي تهدف إلى عزل الخلايا عن الأنسجة الوعائية علامة على صلاحية الخلايا قبل تقييم النهج المطلوب.
البروتوكول الموصوف كاف لتحرير الخلايا البطانية القابلة للحياة للتحليل والتطبيقات النهائية من عينات شريانية ≤1 ملغ مشتقة من الفئران. ومع ذلك ، إذا تم عزل الشرايين ذات الأهمية من أنسجة أو كائنات حية مختلفة (مثل البشر) مما سيؤدي إلى كتل شريانية مختلفة بشكل كبير ، فسيتعين على المرء تحسين محتوى إنزيم الهضم ومدة الحضانة لعزل مجموعة الخلايا ذات الاهتمام بكفاءة. بالنسبة لبعض الأسرة الوعائية التي تبدأ بكميات أصغر من الأنسجة الأولية مقارنة بالأسرة تحت الجلد والمساريقي المعروضة هنا (على سبيل المثال ، الشرايين التاجية) ، قد يكون تجميع الشرايين من عدة فئران ضروريا لكل عينة. في الواقع ، قد تكون هذه خطوة ضرورية لأي سرير وعائي معين بالنظر إلى أن نهج النتائج يتطلب عائدا مرتفعا نسبيا من الخلايا. أحد القيود الرئيسية هو أنه نظرا لطبيعة الاختلافات لكل عينة من عمليات الهضم ، يمكن أن تختلف غلة الخلايا في بعض الأحيان اختلافا كبيرا عبر الدفعات حتى عندما تكون من نفس السرير الوعائي. هذا يمكن أن يسبب مشاكل عند تحليل البيانات ويجب حسابه عن طريق التطبيع عند الاقتضاء. على سبيل المثال ، كان تعبير CD36 متغيرا للغاية في البيانات الخام بسبب التغيرات في غلة الخلايا عبر عينات فردية من الشرايين الدهنية تحت الجلد والمساريقي. لذلك ، تم تطبيع البيانات الخام إلى CD31 + CD45 – متوسط كثافة التألق مع افتراض أن هذه الطريقة ستصحح اختلافات الدفعات (الشكل 4). وبطبيعة الحال، واعتمادا على النهج، قد تكون هناك حاجة إلى تحليلات إحصائية أكثر تطورا وأساليب تطبيع.
باختصار ، تقدم هذه الورقة طريقة لتشريح وعزل وهضم الشرايين تحت الجلد والمساريقي من الفئران للتحقيق في تعبير و / أو وظيفة الأهداف البطانية ذات الاهتمام. مع التعديلات على البروتوكول المقدم ، يمكن التحقيق في أسرة الأوعية الدموية المختلفة وأنواع الخلايا (على سبيل المثال ، خلايا العضلات الملساء). هذا البروتوكول ، كأساس لعدد كبير من الأساليب التجريبية المتاحة ، لديه القدرة على تعزيز فهم بيولوجيا الخلايا الوعائية وآليات خلل الأوعية الدموية.
The authors have nothing to disclose.
في ذكرى محبة لريتش ويست ، عالم لامع وزميل وصديق عزيز. نود أن نشكر جامعة ديلاوير Flow Cytometry و BioImaging Core كجزء من معهد ديلاوير للتكنولوجيا الحيوية على مساهماتهم المستمرة في دراساتنا. كما نود أن نشكر إيما هودجينز على المراجعة الدقيقة للمخطوطة وتحريرها. يتم دعم عملنا من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). تم دعم هذا المشروع أيضا من قبل برنامج ديلاوير INBRE ، مع منحة من NIGMS (P20GM103446) من المعاهد الوطنية للصحة وولاية ديلاوير (I.S. Fancher) ، ومنحة أبحاث جامعة ديلاوير العامة (I.S. Fancher). هذا المحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |