Detta protokoll beskriver en metod för dissektion av musfettdepåer och isolering och matsmältning av respektive artärer för att frigöra och sedan identifiera endotelcellpopulationen. Nyisolerade celler som används i nedströmsapplikationer kommer att främja förståelsen för vaskulär cellbiologi och mekanismerna för vaskulär dysfunktion.
Vaskulära endotelceller som kantar kärlsystemets vägg spelar viktiga roller i en mängd olika fysiologiska processer, inklusive vaskulär tonreglering, barriärfunktioner och angiogenes. Endotelcellsdysfunktion är en kännetecknande prediktor och viktig drivkraft för utvecklingen av allvarliga hjärt-kärlsjukdomar, men de underliggande mekanismerna är fortfarande dåligt förstådda. Förmågan att isolera och utföra analyser på endotelceller från olika kärlbäddar i deras ursprungliga form kommer att ge insikt i processerna vid hjärt-kärlsjukdom. Detta protokoll presenterar proceduren för dissektion av mus subkutana och mesenteriska fettvävnader, följt av isolering av deras respektive arteriella vaskulatur. De isolerade artärerna smälts sedan med hjälp av en specifik cocktail av matsmältningsenzymer som fokuserar på att frigöra funktionellt livskraftiga endotelceller. Den smälta vävnaden bedöms genom flödescytometrianalys med hjälp av CD31+/CD45− celler som markörer för positiv endotelcellsidentifiering. Celler kan sorteras för omedelbara nedströms funktionella analyser eller användas för att generera primära cellinjer. Tekniken för att isolera och smälta artärer från olika vaskulära sängar kommer att ge alternativ för forskare att utvärdera nyligen isolerade vaskulära celler från artärer av intresse och låta dem utföra ett brett spektrum av funktionella tester på specifika celltyper.
Endotelceller är välkända för sina viktiga roller i en mängd olika fysiologiska processer, inklusive barriärfunktioner, angiogenes och vaskulär tonreglering 1,2. Även om endotelcellsdysfunktion är väl dokumenterad för att främja åderförkalkning, högt blodtryck, diabetes etc., är de underliggande mekanismerna som driver endoteldysfunktion fortfarande dåligt förstådda och skiljer sig sannolikt mellan distinkta vaskulära sängar 2,3,4. Ansträngningen att avslöja dessa patologiska mekanismer för endotelcellsdysfunktion utmanas av den begränsade tillgången till en ren population av endotelceller från vävnader och / eller fenotypiska förändringar av endotelceller i odling 5,6. Att kunna isolera och utföra analyser på endotelceller från olika kärlbäddar i sin ursprungliga form kommer därför att ge insikt i processerna vid hjärt-kärlsjukdom.
Detta protokoll presenterar proceduren för att dissekera subkutana och mesenteriska fettvävnader från möss, följt av isolering av deras respektive arteriella vaskulatur. Funktionellt livskraftiga endotelceller som fodrar artärväggarna frigörs med hjälp av en specifik cocktail av enzymer. Särskild försiktighet vidtogs för att optimera villkoren för matsmältningsprotokollet för att erhålla ett tillräckligt utbyte av endotelceller från <1 mg startvävnad samtidigt som biomolekylära markörer hålls intakta för analys. Isolerade endotelceller identifieras därefter med hjälp av flödescytometri. Närvaron av CD31 (PECAM) används för att primärt identifiera endotelceller. På grund av uttrycket av CD31 i andra celltyper, inklusive flera av hematopoetiskt ursprung som också uttrycker CD45, förbättrades renheten hos de isolerade endotelcellerna ytterligare genom uteslutning av celler som uttrycker både CD31 och CD45 5,6,7,8. Dessutom, beroende på forskningsfrågan och de nedströms applikationer som ska användas, bör forskare överväga att välja en omfattande panel av positiva och negativa urvalsmarkörer för att optimera renheten hos cellpopulationen av intresse.
Även om tekniken för att dissekera och isolera fettdepåartärer har använts i de tidigare publikationerna 9,10,11,12,13, har ett detaljerat protokoll som beskriver isoleringen av inbäddade artärer ännu inte presenterats. Att demonstrera tekniken för isolering och matsmältning av artärer från olika vaskulära sängar från en given art av intresse kommer att ge alternativ för forskare att utvärdera nyisolerade vaskulära celler från artärer av intresse och låta dem utföra ett brett spektrum av funktionella tester på specifika celltyper. Tester kan inkludera men är inte begränsade till flödescytometri för cellsortering och membranproteinuttryck5,8, elektrofysiologi för jonkanalaktivitet9, molekylär profilering (proteomik / genomiska analyser etc.) 14,15, och generering av primära cellinjer för läkemedelsscreening in vitro16,17.
Endotelial dysfunktion är en föregångare till allvarliga sjukdomstillstånd, vilket sannolikt driver utvecklingen av åderförkalkning, högt blodtryck och stroke 3,23. Medan de identifierade mekanismerna som ligger till grund för endoteldysfunktion i ett givet patologiskt tillstånd är många, kommer distinkta vaskulära sängar sannolikt att påverkas differentiellt av patologiska tillstånd 4,24. Dessutom inducerar olika kardiovaskulära riskfaktorer (t.ex. fetma, högt blodtryck, dyslipidemi, rökning, diabetes) dysfunktion genom en mängd olika mekanismer23,25. Därför är det viktigt att isolera endotelcellpopulationer från etablerade djurmodeller av sjukdom eller tillgänglig mänsklig vävnad och utföra analyser på celler som omedelbart avlägsnas från in vivo-miljön. Att isolera celler på detta sätt har en unik fördel jämfört med att studera celler i odling genom att de är tomma på odlingsinducerade fenotypiska förändringar 5,6. Dessutom, inklusive en heterogen endotelcellpopulation, som observerats in vivo 26,27 (och som kan separeras ytterligare med hjälp av flödesassisterad cellsortering), från en levande organism informerar bättre in vivo-miljön. Slutligen är denna metod tillämplig på undersökning av många djurmodeller och potentiellt mänsklig vävnad och kan användas för att generera primära cellodlingslinjer, om ett sådant behov är motiverat.
Det kritiska steget i detta protokoll, och det steg som behöver mest justering för olika vaskulära sängar eller celltyper som inte presenteras här, är matsmältningen av kärlvävnad. Detta steg måste optimeras för cellhälsa utan att minska cellutbytet. De specifika enzymer som används och varaktigheten för matsmältningen är avgörande för att optimera cellhälsa och avkastning för att kunna utföra nedströmsanalyser på ett adekvat sätt. För identifiering av membranuttryck av CD36, som detekterats genom flödescytometri i subkutana och mesenteriska endotelceller (figur 4), utvecklades en modifierad version av matsmältningsprotokollet som ursprungligen var utformat för patch-clamp-elektrofysiologi28 . Detta inkluderade en förlängning av kollagenas I matsmältningstid till 30 min för att öka cellutbytet för att bättre möta kraven på flödescytometri jämfört med vad som krävs för patch-clamp-studier. Eftersom denna modifiering kan påverka cellhälsan i viss utsträckning användes en cellviabilitetsfläck i flödescytometrianalyserna för att säkerställa att endast livskraftiga endotelceller bedömdes enligt detta protokoll (figur 3). Det rekommenderas att studier som syftar till att isolera celler från kärlvävnad bör innehålla en markör för cellviabilitet innan man bedömer det önskade tillvägagångssättet.
Det beskrivna protokollet är tillräckligt för att frigöra livskraftiga endotelceller för analys och nedströms applikationer från ≤1 mg arteriella prover härledda från möss; Men om artärerna av intresse skulle isoleras från olika vävnader eller organismer (t.ex. människor) som skulle resultera i signifikant olika arteriella massor, skulle man behöva optimera matsmältningsenzyminnehållet och inkubationens varaktighet för att effektivt isolera cellpopulationen av intresse. För vissa vaskulära sängar som börjar med ännu mindre mängder startvävnad än de subkutana och mesenteriska sängarna som presenteras här (t.ex. kranskärl) kan sammanslagning av artärer från flera möss vara nödvändig per prov. Detta kan faktiskt vara ett nödvändigt steg för en viss kärlbädd med tanke på att resultatmetoden kräver ett relativt högt cellutbyte. En stor begränsning är att på grund av variationerna per provförtunning kan cellutbytet ibland vara signifikant olika över satser även från samma kärlbädd. Detta kan orsaka problem vid analys av data och bör redovisas via normalisering när det är lämpligt. Till exempel var CD36-uttrycket extremt variabelt i rådata på grund av förändringar i cellutbyten över enskilda prover av subkutana och mesenteriska fettartärer. Därför normaliserades rådata till CD31 + CD45 – genomsnittlig fluorescensintensitet med antagandet att denna metod skulle korrigera för batchskillnader (figur 4). Naturligtvis, beroende på tillvägagångssätt, kan mer sofistikerade statistiska analyser och normaliseringsmetoder krävas.
Sammanfattningsvis presenterar detta papper en metod för att dissekera, isolera och smälta subkutana och mesenteriska artärer från möss för att undersöka uttrycket och / eller funktionen hos endotelmål av intresse. Med modifieringar av det presenterade protokollet kan olika vaskulära sängar och celltyper (t.ex. glattmuskelceller) undersökas. Detta protokoll, som en grund för en uppsjö av tillgängliga experimentella tillvägagångssätt, har potential att främja förståelsen för vaskulär cellbiologi och mekanismer för vaskulär dysfunktion.
The authors have nothing to disclose.
Till kärleksfullt minne av Rich West, en lysande forskare, kollega och kär vän. Vi vill tacka University of Delaware Flow Cytometry och BioImaging Core som en del av Delaware Biotechnology Institute för deras pågående bidrag till våra studier. Vi vill också tacka Emma Hudgins för den noggranna genomgången och redigeringen av manuskriptet. Vårt arbete stöds av National Institute of General Medical Sciences P20GM113125-6564 (I.S. Fancher). Detta projekt stöddes också av Delaware INBRE-programmet, med ett bidrag från NIGMS (P20GM103446) från National Institutes of Health och delstaten Delaware (I.S. Fancher) och ett University of Delaware General University Research-bidrag (I.S. Fancher). Detta innehåll är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis NIH: s officiella åsikter.
Tissue dissection tools | |||
5 forceps (2) | Fine Science Tools | 11252-00 | For isolation of mesenteric adipose depot and arteries transfer |
55 forceps (2) | Fine Science Tools | 11295-51 | For parenchymal adipose removal |
Curved Bonn scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | For isolation of mesenteric adipose depot |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Straight Bonn scissor | Fine Science Tools | 14060-09 | For general dissection steps and isolation of subcutaneous adipose depot |
Stereoscope with light source | Laxco | Z230PT40 | For parenchymal adipose removal and artery isolation |
Digestive enzymes for Artery Digestion | |||
Collagenase Type I | Wothington-BioChem | LS004194 | |
Dispase (Neutral Protease) | Wothington-BioChem | LS02110 | |
Elastase | Wothington-BioChem | LS002292 | |
Solutions Recipes | |||
HEPES Buffer, pH 7.4 | Final concentration | ||
Calcium chloride dihydrate | J.T.Baker | 1332-1 | 2 mM |
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 1 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 5 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 145 mM |
Dissociation Solution, pH 7.30-7.40 | |||
Dextrose (D-glucose) anhydrous | Fisher | D16-500 | 10 mM |
HEPES | Fisher | BP310-500 | 10 mM |
Magnesium Chloride | Fisher | M33-500 | 2 mM |
Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | 56 mM |
Sodium chloride | Oxoid | LP0005 | 55 mM |
Sodium L-Glutamate monohydrate | TCI | G0188 | 80 mM |
Flow Cytometry Analyses | |||
5 mL Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Falcon | 352235 | |
CD31-PE | Miltenyi Biotec | 130-119-653 | 0.75µg/sample |
CD36-APC | R&D Systems | AF2519 | 2.5µg/ sample |
CD45-FITC | BioLegend | 103108 | 2.5µg/ sample |
Live/Dead Fixable Violet Dead Cell Staining kit (cell viability stain) | Invitrogen | L34955 | 1µL/sample |