Sammankopplade makroporösa 3D-ställningar från Microgel Stavar
Summary
Microgelstavar med komplementära reaktiva grupper produceras via mikrofluidik med förmågan att sammanlänka i vattenlösning. De anisometriska mikrogelerna fastnar och kopplas samman till stabila konstruktioner med större porer jämfört med sfäriska baserade system. Mikrogeler modifierade med GRGDS-PC bildar makroporösa 3D-konstruktioner som kan användas för cellodling.
Abstract
Ett tvåkomponentsystem av funktionaliserade mikrogeler från mikrofluidik möjliggör snabb sammankoppling till 3D-makroporösa konstruktioner i vattenhaltiga lösningar utan ytterligare tillsatser. Kontinuerlig fotoinitierad on-chip-gelering möjliggör variation av mikrogel-bildförhållandet, vilket bestämmer byggstensegenskaperna för de erhållna konstruktionerna. Glycidylmetakrylat (GMA) eller 2-aminoetylmetakrylat (AMA) monomerer sampolymeriseras i mikrogelnätverket baserat på polyetylenglykol (PEG) stjärnpolymerer för att uppnå antingen epoxi- eller aminfunktionalitet. Ett fokuserande oljeflöde införs i den mikrofluidiska utloppsstrukturen för att säkerställa kontinuerlig insamling av de funktionaliserade mikrogelstavarna. Baserat på en ny publikation resulterar mikrogelstångsbaserade konstruktioner i större porer på flera hundra mikrometer och leder samtidigt till totalt sett högre ställningsstabilitet jämfört med en sfäriskt baserad modell. På detta sätt är det möjligt att producera konstruktioner med högre volym med mer fri volym samtidigt som mängden material som krävs minskas. De sammanlänkade makroporösa ställningarna kan plockas upp och transporteras utan skador eller sönderfall. Amin- och epoxigrupper som inte är involverade i sammankoppling förblir aktiva och kan användas oberoende för postmodifiering. Detta protokoll beskriver en optimerad metod för tillverkning av mikrogelstavar för att bilda makroporösa sammankopplade byggnadsställningar som kan användas för efterföljande cellexperiment.
Introduction
För att studera komplext kooperativt cellbeteende i 3D-konstruktioner måste ställningsplattformar visa konsekvent prestanda i reproducerbarhet, ha lämplig geometri för cellmigration och samtidigt tillåta viss flexibilitet när det gäller parameterförändring för att undersöka deras inflytande på den levande vävnaden1. Under de senaste åren har begreppet makroporösa glödgade partiklar (MAP), som först beskrivits av Segura et al., utvecklats till en effektiv och mångsidig plattform för 3D-ställningsproduktion2. Den skräddarsydda sammansättningen av mikrogelerna, som är byggstenarna i den slutliga 3D-ställningen, fördefinierar egenskaper såsom konstruktionens styvhet, gelnätverkets selektiva kemiska reaktivitet och ställningens slutliga porstorlek 2,3,4,5,6. Cellhäftande peptider som ledtrådar för byggnadsställning-cellinteraktioner införlivas i mikrogelernas polymernätverk för att möjliggöra cellbindning och kan varieras för att undersöka deras specifika effekter på celler i odling. 3D-ställningarna stabiliseras genom sammankoppling av de glödgade injicerbara mikrogelerna på grund av kovalenta eller supramolekylära bindningar, vilket resulterar i robusta och definierade konstruktioner för cellodling 2,3,5,7,8.
Mikrofluidik har etablerat sig som en av de mest exakta och anpassningsbara metoderna för framställning av definierade granulära hydrogeler9. Möjligheten att producera större mängder av de erforderliga byggstenarna i en kontinuerlig process samtidigt som deras kemiska, mekaniska och fysiska monodispersitet bibehålls bidrar väsentligt till lämpligheten av denna process. Vidare kan storleken och formen på de producerade mikrogelerna manipuleras med olika metoder såsom batchemulsioner, mikrofluidik, litografi, elektrodynamisk sprutning eller mekanisk fragmentering, som bestämmer byggstenarnas geometri och därmed 3D-strukturen hos den slutliga ställningen 1,10.
Nyligen har begreppet makroporösa 3D-ställningar bestående av funktionaliserade mikrogelstavar som snabbt kopplas samman i vattenlösningar utan ytterligare tillsatser rapporterats11. Anisotropin hos mikrogelstavar resulterade i högre porositeter och porfördelningar med större porstorlekar jämfört med att använda sfäriska mikrogeler i denna studie11. På så sätt skapar mindre material större porer med en mängd olika porgeometrier samtidigt som stabiliteten i 3D-ställningen bibehålls. Systemet består av två typer av mikrogelstavar med komplementära primära amin- och epoxifunktionella grupper som konsumeras inom den sammanlänkande reaktionen när de kommer i kontakt med varandra. De funktionella grupperna som inte deltar i sammankopplingsprocessen förblir aktiva och kan användas för selektiv eftermodifiering med cellhäftande peptider eller andra bioaktiva faktorer. Fibroblastceller fäster, sprider sig och sprider sig när de odlas inuti 3D-ställningarna, växer först på mikrogelytan och fyller de flesta makroporerna efter 5 dagar. En preliminär samodlingsstudie av humana fibroblaster och humana navelvenendotelceller (HUVEC) visade lovande resultat för bildandet av kärlliknande strukturer inom de sammanlänkade 3D-ställningarna11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett av de kritiska stegen i detta protokoll är kvaliteten på 2-aminoetylmetakrylatet (AMA) som används som komonomer för primär aminfunktionalisering. AMA ska vara ett finkornigt och helst färglöst pulver som levereras i en gastät brun glasbehållare. Man bör undvika att använda grönaktigt och klumpigt material, eftersom det väsentligt försämrar geleringsreaktionen och negativt påverkar resultatens reproducerbarhet. Vid dålig gelering och instabila mikrogelstavar kan man överväga att byta leverantör.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uttrycker vår tacksamhet till medförfattarna till vårt tidigare arbete som denna metod bygger på, Céline Bastard, Luis P. B. Guerzoni, Yonca Kittel, Rostislav Vinokur, Nikolai Born och Tamás Haraszti. Vi erkänner tacksamt finansiering från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) inom projektet B5 och C3 SFB 985 “Functional Microgels and Microgel Systems”. Vi erkänner finansiering från Leibniz Senate Competition Committee (SAW) under Professorinnenprogrammet (SAW-2017-PB62: BioMat). Vi erkänner uppriktigt finansiering från Europeiska kommissionen (EUSMI, 731019). Detta arbete utfördes delvis vid Center for Chemical Polymer Technology (CPT), som stöddes av EU och förbundsstaten Nordrhein-Westfalen (bidrag EFRE 30 00 883 02).
Materials
| ABIL EM 90 | Evonik | 144243-53-8 | non-ionic surfactant |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride | TCI Chemicals | A3413 | >98.0%(T)(HPLC) |
| 8-Arm PEG-acrylate 20 kDa | Biochempeg Scientific Inc. | A88009-20K | ≥ 95 % |
| AutoCAD 2019 | Autodesk | computer-aided design (CAD) software; modeling of microfluidic designs | |
| CHROMAFIL MV A-20/25 syringe filter | XH49.1 | pore size 0.20 µm; Cellulose Mixed Esters (MV) | |
| Cover glass | Marienfeld-Superior | type No. 1 | |
| EMS Swiss line core sampling tool 0.75 mm | Electron Microscopy Sciences | 0.77 mm inner diameter, 1.07 mm outer diameter | |
| Ethanol absolut | VWR Chemicals | ||
| FL3-U3-13Y3M 150 FPS series high-speed camera | FLIR Systems | ||
| Fluoresceinamine isomer I | Sigma-Aldrich | 201626 | |
| Fluorescein isothiocyanate | Thermo Fisher Scientific | 46424 | |
| 25G x 5/8’’ 0,50 x 16 mm needles | BD Microlance 3 | ||
| Glycidyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 779342 | ≥97.0% (GC) |
| GRGDS-PC | CPC Scientific | FIBN-015A | |
| Hamilton 1000 Series Gastight syringes | Thermo Fisher Scientific | 10772361/10500052 | PFTE Luer-Lock |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 1,04,367 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate | Sigma-Aldrich | 900889 | ≥95 % |
| Motic AE2000 trinocular microscope | Ted Pella, Inc. | 22443-12 | |
| Novec 7100 | Sigma-Aldrich | SHH0002 | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O9755 | |
| Paraffin | VWR Chemicals | 24679320 | |
| Pavone Nanoindenter Platform | Optics11Life | ||
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Polyethylene Tubing 0.38×1.09mm medical grade | dropletex | ID 0.38 mm OD 1.09 mm | |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Protein LoBind Tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| Pump 11 Pico Plus Elite Programmable Syringe Pump | Harvard Apparatus | ||
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11530586 | |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow SYLGARD | 634165S | |
| Trichloro-(1H,1H,2H,2H-perfluoroctyl)-silane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| UVC LED sterilizing box | UVLED Optical Technology Co., Ltd. | 9S SZH8-S2 |
References
- Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. 5 (1), 20-43 (2020).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., Di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Truong, N. F., et al. Microporous annealed particle hydrogel stiffness, void space size, and adhesion properties impact cell proliferation, cell spreading, and gene transfer. Acta Biomaterialia. 94, 160-172 (2019).
- Sheikhi, A., et al. Microfluidic-enabled bottom-up hydrogels from annealable naturally-derived protein microbeads. Biomaterials. 192, 560-568 (2019).
- de Rutte, J. M., Koh, J., Di Carlo, D. Scalable high-throughput production of modular microgels for in situ assembly of microporous tissue scaffolds. Advanced Functional Materials. 29 (25), 1900071 (2019).
- Hsu, R. -. S., et al. Adaptable microporous hydrogels of propagating NGF-gradient by injectable building blocks for accelerated axonal outgrowth. Advanced Science. 6 (16), 1900520 (2019).
- Caldwell, A. S., Campbell, G. T., Shekiro, K. M. T., Anseth, K. S. Clickable microgel scaffolds as platforms for 3D cell encapsulation. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), 1700254 (2017).
- Chen, Z., et al. Advanced microfluidic devices for fabricating multi-structural hydrogel microsphere. Exploration. 1 (3), 20210036 (2021).
- Qazi, T. H., et al. Anisotropic rod-shaped particles influence injectable granular hydrogel properties and cell invasion. Advanced Materials. 34 (12), 2109194 (2022).
- Rommel, D., et al. Functionalized microgel rods interlinked into soft macroporous structures for 3D cell culture. Advanced Science. 9 (10), 2103554 (2022).
- Guerzoni, L. P. B., et al. Cell encapsulation in soft, anisometric poly(ethylene) glycol microgels using a novel radical-free microfluidic system. Small. 15 (20), 1900692 (2019).
- Krüger, A. J. D., et al. Compartmentalized jet polymerization as a high-resolution process to continuously produce anisometric microgel rods with adjustable size and stiffness. Advanced Materials. 31 (49), 1903668 (2019).
- Darling, N. J., et al. Click by click microporous annealed particle (MAP) scaffolds. Advanced Healthcare Materials. 9 (10), 1901391 (2020).
- Lutzweiler, G., Ndreu Halili, ., Engin Vrana, N. The overview of porous, bioactive scaffolds as instructive biomaterials for tissue regeneration and their clinical translation. Pharmaceutics. 12 (7), 602 (2020).
- Dang, H. P., et al. 3D printed dual macro-, microscale porous network as a tissue engineering scaffold with drug delivering function. Biofabrication. 11 (3), 035014 (2019).
- Highley, C. B., Song, K. H., Daly, A. C., Burdick, J. A. Jammed microgel inks for 3D printing applications. Advanced Science. 6 (1), 1801076 (2019).
