تصف هذه المقالة تقنية لتقسيم العظام الصدغية البشرية السريعة التي تستخدم منشارا دقيقا مع شفرات الماس المزدوجة لتوليد شرائح رقيقة لإزالة الكلس السريع وتحليل الكيمياء المناعية للعظام الصدغية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقسيم العظام الصدغية البشرية عالي السرعة لتقييم أمراض الأذن الوسطى المرتبطة ب COVID-19
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد التحليل النسيجي المرضي لأقسام العظام الصدغية البشرية تقنية أساسية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى. يتم تحضير أقسام العظام الصدغية عن طريق حصاد العظام الصدغي بعد الوفاة ، والتثبيت ، وإزالة الكلس ، والتضمين ، والتلطيخ. نظرا لكثافة العظم الصدغي ، فإن إزالة الكلس هي عملية تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الاستخدام للموارد. قد يستغرق إعداد الأنسجة الكامل 9-10 أشهر في المتوسط. هذا يبطئ أبحاث أمراض الأذن ويعيق الدراسات الحساسة للوقت ، مثل تلك المتعلقة بجائحة COVID-19. تصف هذه الورقة تقنية للتحضير السريع وإزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية لتسريع معالجة الأنسجة.
تم حصاد العظام الصدغية بعد الوفاة باستخدام التقنيات القياسية وتثبيتها في الفورمالين بنسبة 10٪. تم استخدام منشار دقيق مع شفرات الماس المزدوجة لقطع كل قسم إلى ثلاثة أقسام سميكة. ثم تم إزالة الكلس من أقسام العظام الصدغية السميكة في محلول إزالة الكلس لمدة 7-10 أيام قبل أن يتم تضمينها في البارافين ، وتقسيمها إلى أقسام رقيقة (10 ميكرومتر) باستخدام التبريد ، وتركيبها على شرائح غير مشحونة. ثم تم إزالة عينات الأنسجة وإعادة ترطيبها لتلطيخ الأجسام المضادة (ACE2 و TMPRSS2 و Furin) وتصويرها. خفضت هذه التقنية الوقت من الحصاد إلى تحليل الأنسجة من 9-10 أشهر إلى 10-14 يوما. قد يزيد تقسيم العظام الصدغي عالي السرعة من سرعة أبحاث أمراض الأذن ويقلل من الموارد اللازمة لإعداد الأنسجة ، مع تسهيل الدراسات الحساسة للوقت مثل تلك المتعلقة ب COVID-19.
المقدمة
توفر أبحاث العظام الصدغية البشرية موردا لا يقدر بثمن لدراسة علم الأمراض والفيزيولوجيا المرضية للأذن الداخلية والوسطى. قبل القرن التاسع عشر ، لم يكن يعرف سوى القليل عن مرض الأذن1،2،3. لفهم مرض الأذن بشكل أفضل و "إنقاذ الجراحة السمعية من أيدي الدجالين" ، طور جوزيف توينبي (1815-1866) طرقا لدراسة الأقسام النسيجية للعظم الصدغي البشري3. تم تعزيز هذا العمل من قبل آدم بوليتزر (1835-1920) في فيينا وغيرها في جميع أنحاء أوروبا خلال الفترة المتبقية من القرن التاسع عشر ، الذي استخدم أقسام العظام الصدغية لوصف الأنسجة المرضية للعديد من الحالات الشائعة التي تؤثر على ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تطوير هذا البروتوكول بموافقة IRB (IRB00250002) ووفقا للسياسات المؤسسية لاستخدام الأنسجة البشرية والمواد المعدية. قدم كل متبرع بالعظام الصدغية موافقة خطية قبل الوفاة، أو تم الحصول على الموافقة بعد وفاته من عائلة المتبرع. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول.
1. حصاد العظام الزمنية
- الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية المحلية (IRB) ، ومراجعة السياسات المؤسسية لاستخدام المواد البشرية والمعدية ، والحصول على موافقة للتبرع بالأنسجة قبل استخدام هذا البروتوكول.
- ضع معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) قبل العمل مع الأنسجة من المتب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين في الغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنبوب استاكيوس الحفاظ على الغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنسجة الأذن الوسطى تحت المخاطية بعد المعالجة (الشكل 1). أظهرت الصور الكيميائية النسيجية المناعية تعبيرا عن بروتينات ACE2 و TMPRSS2 و Furin داخل الغشاء المخاطي للأذن الوسطى وأنبوب استاكيوس (الشكل 1). يوفر وجود هذه البروتينات داخل الأذن الوسطى طريقا محتملا قد يصيب SARS-CoV-2 ظهارة الجهاز التنفسي داخل الأذن الوسطى11,12,13
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعد أبحاث العظام الصدغية البشرية أمرا بالغ الأهمية لدراسة أمراض الأذن الداخلية والوسطى ولكنها تظل مسعى كثيف الوقت والموارد. تصف هذه الورقة تقنية تستخدم المنشار الدقيق الماسي لتوليد أقسام عظمية صدغية سميكة يمكن إزالتها بسرعة قبل مزيد من التقسيم بحيث يمكن تقليل الوقت من حصاد الأنسجة إلى الدراسة من 9-10 أشهر إلى 10-14 يوما. قد تقلل هذه التقنية من الموارد اللازمة لمعالجة العظام الصدغية وتسهل الدراسات الحساسة للوقت ، مثل تلك المتعلقة بأمراض الأذن الوسطى والداخلية13 COVID-19 ، والتي كانت الدافع لتطوير ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
شكر وتقدير
ونشكر محمد ليهار على مساعدته في هذا المشروع. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (T32DC000027 ، NSA).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجسم المضاد المضاد ل ACE-2 (التخفيف التطبيقي 1:50) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| الأجسام المضادة المضادة للفورين (1: 250 التخفيف) | Abcam | EPR 14674 | |
| الجسم المضاد المضاد TMPRSS2 (1: 1،000 تخفيف) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 نظام يدوي مجهر | أوليمبوس حلول علوم | ||
| الحياة CBN / Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - كاميرا | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 | مزدوجة نيكون | ||
| (محلول حجب تجاري) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| محلول فورمالين محايد مخزن مؤقت 10٪ | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (محلول إزالة الكلس من حمض الفورميك) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conrupgated المضاد للأرانب الجسم المضاد المضاد للأرانب (1:100 تخفيف) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit ، بيروكسيداز (1:100 تخفيف) | مختبرات ناقلات | MP-7405 | |
| لامبوت أوستيوتوم | جراحية مارت | SM1553 | |
| المعادن PICO 155P تقنيات المنشار الدقيق | سرعة | PICO 155P | منشار |
| ميكرو NIS عناصر البرنامج الإصدار 4.6 | نيكون | ||
| بارابلاست بلس | سيجما ألدريتش | P3683 | البارافين |
| شرائح مجهر مشحونة إيجابية مع منتجات | والتر | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | للتبريد Triotome |
| (محلول المعالجة المسبقة التجاري) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
المراجع
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
