शारीरिक रूप से विशिष्ट एकल-कोशिका जीन अभिव्यक्ति विधियों के साथ व्यसन व्यवहार में एंटीरिवार्ड के ड्राइवरों की जांच करना
Summary
लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन और माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर का संयोजन एकल न्यूरॉन्स और ग्लिया में ट्रांसस्क्रिप्टम को मापने में शारीरिक और जैव तकनीकी विशिष्टता प्रदान करता है। मनोवैज्ञानिक रोग के लिए एक प्रणाली के जीव विज्ञान दृष्टिकोण के साथ रचनात्मक तरीकों को लागू करने से लत में न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड परिकल्पना जैसे समझ और उपचार में सफलताएं मिल सकती हैं।
Abstract
व्यसन व्यवहार की बढ़ती दरों ने मानसिक स्वास्थ्य शोधकर्ताओं और चिकित्सकों को समान रूप से एंटीरिवार्ड और रिकवरी को समझने के लिए प्रेरित किया है। इनाम और शुरुआत से दूर इस बदलाव के लिए लत की जांच के लिए लागू तरीकों के विस्तार के साथ-साथ नए दृष्टिकोण, प्रतिमान और परिकल्पना की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक उदाहरण प्रदान करते हैं: एंटीरिवार्ड की जांच करने के लिए एक सिस्टम जीवविज्ञान दृष्टिकोण जो लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) और उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रियाओं (आरटी-क्यूपीसीआर) को जोड़ता है। जीन अभिव्यक्ति नेटवर्क गतिशीलता को मापा गया और शराब और ओपिओइड वापसी, न्यूरोइन्फ्लेमेशन में न्यूरोविसेरल डिसरेग्यूलेशन के एक प्रमुख चालक की पहचान की गई। प्रौद्योगिकियों का यह संयोजन उच्च-थ्रूपुट संवेदनशीलता और विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति उपायों के साथ एकल-कोशिका संकल्प पर शारीरिक और फेनोटाइपिक विशिष्टता प्रदान करता है जो परिकल्पना पैदा करने वाले डेटासेट और यांत्रिक संभावनाओं दोनों को उत्पन्न करता है जो नवीन अंतर्दृष्टि और उपचार के अवसर उत्पन्न करते हैं।
Introduction
विकसित दुनिया में लत एक बढ़ती हुई चुनौती बनी हुई है 1,2. प्रमुख वैज्ञानिक और नैदानिक प्रगति के बावजूद, व्यसन की दर में वृद्धि जारी है, जबकि स्थापित उपचारों की प्रभावकारितासर्वोत्तम 3,4,5 पर स्थिर रहती है। हालांकि, जैव प्रौद्योगिकी और वैज्ञानिक दृष्टिकोण में प्रगति ने पदार्थ निर्भरता 6,7,8 के पैथोफिज़ियोलॉजी की जांच करने के लिए नए तरीकों और परिकल्पनाओं को जन्म दिया है। दरअसल, हाल के घटनाक्रमों से पता चलता है कि नई अवधारणाओं और उपचार प्रतिमानों से सामाजिक, आर्थिक और राजनीतिक परिणामों के साथ सफलताएं हो सकती हैं 9,10,11,12।
हमने शराब और ओपिओइड निर्भरता13,14,15,16 की वापसी में एंटीरिवॉर्ड की जांच की। विधियाँ इस प्रतिमान17,18 के लिए केंद्रीय हैं। लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) उच्च शारीरिक विशिष्टता के साथ एकल कोशिकाओं का चयन कर सकता है। यह कार्यक्षमता न्यूरोइन्फ्लेमेशन एंटीरिवार्ड परिकल्पना का अभिन्न अंग है क्योंकि ग्लिया और न्यूरॉन्स दोनों को एक ही जानवर 13,14,15,16,19 में एक ही न्यूरोनल सबन्यूक्लियस से एकत्र और विश्लेषण किया जा सकता है। चयनित कोशिकाओं के प्रतिलेख के एक प्रासंगिक हिस्से को तब उच्च-थ्रूपुट माइक्रोफ्लुइडिक रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के साथ मापा जा सकता है, जो कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के लिए उच्च आयामी डेटासेट प्रदान करता है जो कार्यात्मक नेटवर्क20,21 में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
एक विशिष्ट मस्तिष्क नाभिक में न्यूरॉन्स और ग्लिया में ट्रांसस्क्रिप्टम के उप-समूह को मापना एक डेटासेट उत्पन्न करता है जो नमूना संख्या और जीन दोनों में मजबूत होता है और संवेदनशील और विशिष्ट होता है। ये उपकरण मनोवैज्ञानिक रोग के लिए एक प्रणाली के तंत्रिका विज्ञान दृष्टिकोण के लिए इष्टतम हैं क्योंकि ग्लिया, मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया, ने पिछले दशक22,23 में न्यूरोलॉजिकल और मनोरोग रोग में एक केंद्रीय भूमिका का प्रदर्शन किया है। हमारा दृष्टिकोण स्थानीय पैराक्राइन सिग्नलिंग में शामिल कई रिसेप्टर्स और लिगेंड में ग्लिया और न्यूरॉन्स की अभिव्यंजक प्रतिक्रिया को माप सकता है। दरअसल, फजी लॉजिक24 जैसे विभिन्न मात्रात्मक तरीकों का उपयोग करके इन डेटासेट से सिग्नलिंग का अनुमान लगाया जा सकता है। इसके अलावा, न्यूरॉन्स या ग्लिया में सेलुलर सबफेनोटाइप्स की पहचान और उनके कार्य इस बात की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं कि विशिष्ट नाभिक में मस्तिष्क कोशिकाएं एकल-कोशिका स्तर पर कैसे व्यवस्थित, प्रतिक्रिया और विनियमन करती हैं। इस कार्यात्मक प्रणाली की गतिशीलता को समय श्रृंखलाप्रयोगों 16 के साथ भी मॉडलिंग किया जा सकता है। अंत में, पशु मॉडल को इस प्रणाली के दृष्टिकोण के लिए एक यंत्रवत स्थिति देने के लिए शारीरिक या औषधीय रूप से परेशान किया जा सकता है।
प्रतिनिधि प्रयोग:
नीचे, हम इन विधियों के आवेदन का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। इस अध्ययन ने शराब निर्भरता और बाद में वापसी के जवाब में एकान्त नाभिक (एनटीएस) में चूहे न्यूरोनल और माइक्रोग्लिया जीन अभिव्यक्ति की जांचकी। चूहे के समूहों में 1) नियंत्रण, 2) इथेनॉल-निर्भर (ईटीओएच), 3) 8 एच निकासी (डब्ल्यूडी), 4) 32 एच डब्ल्यूडी, और 5) 176 एच डब्ल्यूडी (चित्रा 1 ए) शामिल थे। तेजी से विघटन के बाद, ब्रेनस्टेम को फोरब्रेन और क्रायोसेक्शन से अलग किया गया था, और टायरोसिन हाइड्रॉक्सिलेज-पॉजिटिव (टीएच +) न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया (चित्रा 1 बी) के लिए स्लाइस दाग दिए गए थे। एलसीएम का उपयोग टीएच + और टीएच- न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लिया दोनों को इकट्ठा करने के लिए किया गया था। सभी कोशिकाएं एनटीएस से थीं और 10-सेल पूल के नमूने के रूप में विश्लेषण किया गया था। आरटी-क्यूपीसीआर प्लेटफॉर्म पर 65 जीन (चित्रा 1 बी-सी) को मापने वाले चार 96 x 96 माइक्रोफ्लुइडिक आरटी-क्यूपीसीआर गतिशील सरणी चलाए गए थे। डेटा को -1सीटी विधि का उपयोग करके सामान्यीकृत किया गया था और आर का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था, और एकल-सेल चयन को आणविक मार्करों (चित्रा 1 डी-ई) के साथ मान्य किया गया था। तकनीकी सत्यापन को एक बैच के भीतर और बैचों में विश्लेषण किए गए तकनीकी प्रतिकृतियों द्वारा सत्यापित किया गया था (चित्रा 2 और चित्रा 3)। टीएच + और टीएच- न्यूरॉन्स समान भड़काऊ जीन समूहों के साथ विभिन्न उप फेनोटाइप में संगठित होते हैं, लेकिन अलग-अलग γ-एमिनोब्यूट्रिक एसिड (जीएबीए) रिसेप्टर (आर) क्लस्टर (चित्रा 4 और चित्रा 5)। भड़काऊ जीन समूहों की उच्च अभिव्यक्ति वाले उप फेनोटाइप ्स को 32 एच डब्ल्यूडी पर अधिक प्रतिनिधित्व दिया गया था, जबकि जीएबीए-रिसेप्टर (जीएबीएआर) अभिव्यक्ति लंबे समय तक शराब वापसी (176 एच डब्ल्यूडी) में कम रही। यह काम शराब और ओपिओइड निर्भरता की एंटीरिवार्ड परिकल्पना में योगदान देता है जो अनुमान लगाता है कि वापसी में विसरा से इंटरसेप्टिव फीडबैक आंत-भावनात्मक न्यूरोनल नाभिक (यानी, एनटीएस और एमिग्डाला) के डिसरेग्यूलेशन में योगदान देता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक गंभीर स्वायत्त और भावनात्मक सीक्वेल होते हैं, जो पदार्थ निर्भरता में योगदान करते हैं (चित्रा 6)।
Protocol
Representative Results
Discussion
शराब का उपयोग विकार इलाज के लिए एक चुनौतीपूर्ण बीमारी बनी हुई है। हमारे समूह ने सिस्टम न्यूरोसाइंस परिप्रेक्ष्य के साथ एंटीरिवॉर्ड प्रक्रियाओं की जांच करके इस विकार से संपर्क किया है। हमने अल्कोहल व…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यहां प्रस्तुत कार्य को एनआईएच एचएलबी यू01 एचएल133360 के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था, एनआईडीए आर 21 डीए 036372 जेएस और ईवीबी को सम्मानित किया गया था, टी 32 एए -007463 एसजेओ के समर्थन में जान होक को सम्मानित किया गया था, और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ अल्कोहलिज्म एंड अल्कोहल एब्यूज: आर01 एए018873।
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
