फॉर्मलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों के मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग का उपयोग करके ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की समझ का विस्तार करना
Summary
कैंसर इम्यूनोथेरेपी के युग में, ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट गतिशीलता को स्पष्ट करने में रुचि काफी बढ़ गई है। यह प्रोटोकॉल अपने धुंधला और इमेजिंग चरणों के संबंध में एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग तकनीक का विवरण देता है, जो अत्यधिक मल्टीप्लेक्स स्थानिक विश्लेषण की अनुमति देता है।
Abstract
प्रतिरक्षा-आधारित उपचारों में प्रगति ने कैंसर के उपचार और अनुसंधान में क्रांति ला दी है। इसने ट्यूमर प्रतिरक्षा परिदृश्य के लक्षण वर्णन के लिए बढ़ती मांग को ट्रिगर किया है। यद्यपि मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री ऊतक वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, यह मार्करों की एक छोटी संख्या के विश्लेषण तक सीमित है। इसके विपरीत, प्रवाह साइटोमेट्री जैसी तकनीकें एक साथ कई मार्करों का मूल्यांकन कर सकती हैं, हालांकि ऊतक आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी खो जाती है। हाल के वर्षों में, फेनोटाइपिक और स्थानिक विश्लेषण को एकीकृत करने वाली बहुसंकेतित रणनीतियां ट्यूमर प्रतिरक्षा परिदृश्य के लक्षण वर्णन के लिए व्यापक दृष्टिकोण के रूप में उभरी हैं। यहां, हम धातु-लेबल एंटीबॉडी और माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संयोजन वाली एक अभिनव तकनीक पर चर्चा करते हैं जो परख विकास और अनुकूलन, ऊतक तैयारी और छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण में तकनीकी चरणों पर ध्यान केंद्रित करता है। धुंधला होने से पहले, एक धातु-लेबल एंटीबॉडी पैनल विकसित और अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह हाय-प्लेक्स छवि प्रणाली एक एकल ऊतक अनुभाग में 40 धातु-टैग एंटीबॉडी का समर्थन करती है। ध्यान दें, पैनल में शामिल मार्करों की संख्या के साथ सिग्नल हस्तक्षेप का खतरा बढ़ जाता है। पैनल डिजाइन के बाद, इस हस्तक्षेप को कम करने के लिए एंटीबॉडी को धातु आइसोटोप असाइनमेंट पर विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए। प्रारंभिक पैनल परीक्षण एंटीबॉडी के एक छोटे सबसेट और नियंत्रण ऊतकों में पूरे पैनल के बाद के परीक्षण का उपयोग करके किया जाता है। फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों को प्राप्त किया जाता है और सोने के लेपित स्लाइड पर घुड़सवार किया जाता है और आगे दाग दिया जाता है। धुंधला होने में 2 दिन लगते हैं और बारीकी से मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला जैसा दिखता है। एक बार नमूने दाग रहे हैं, वे छवि अधिग्रहण साधन में रखा जाता है। दृश्य के फ़ील्ड का चयन किया जाता है, और छवियों को अधिग्रहित, अपलोड और संग्रहीत किया जाता है। अंतिम चरण सिस्टम के छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके हस्तक्षेप को फ़िल्टर करने और हटाने के लिए छवि तैयारी है। इस प्लेटफ़ॉर्म का एक नुकसान विश्लेषणात्मक सॉफ़्टवेयर की कमी है। हालांकि, उत्पन्न छवियों को विभिन्न कम्प्यूटेशनल पैथोलॉजी सॉफ्टवेयर द्वारा समर्थित किया जाता है।
Introduction
क्लोनल ट्यूमर आबादी के आसपास के कई सेल प्रकारों का महत्व कार्सिनोजेनेसिस के वर्गीकरण में एक महत्वपूर्ण तत्व है। कैंसर उपचार शस्त्रागार के हिस्से के रूप में प्रतिरक्षा-आधारित चिकित्सा की स्थापना के बाद इस ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट (टीएमई) संरचना और इंटरैक्शन को स्पष्ट करने में रुचि लगातार बढ़ी है। इसलिए, उपचार रणनीतियों को ट्यूमर-केंद्रित दृष्टिकोण से टीएमई-केंद्रित एक में स्थानांतरित कर दियागया है 1.
ट्यूमर निगरानी और कैंसर के विकास में प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भूमिकाओं को स्पष्ट करने के प्रयासों में हाल के वर्षों में हड़ताली रूप से वृद्धि हुई है 2,3. चिकित्सा अनुसंधान में, साइटोमेट्री-आधारित विधियों और सिंगलप्लेक्स और मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों सहित कई विधियां, टीएमई के कई तत्वों की अनूठी बातचीत को समझने के इस प्रयास के हिस्से के रूप में उत्पन्न हुईं।
फ्लो साइटोमेट्री (1960 के दशक में आविष्कार), प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग और मास साइटोमेट्री जैसे अग्रणी तरीके मुख्य रूप से टीएमई घटकों की पहचान और मात्रा निर्धारित करने पर केंद्रित हैं4. भले ही साइटोमेट्री-आधारित मात्रात्मक तकनीक प्रतिरक्षा परिदृश्य फेनोटाइपिंग की अनुमति देती है, सेलुलर स्थानिक वितरण का निर्धारण असंभव है। इसके विपरीत, मानक सिंगलप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री जैसे तरीके ऊतक वास्तुकला को संरक्षित करते हैं और शोधकर्ताओं को सेलुलर वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम बनाते हैं, हालांकि एक एकल ऊतक अनुभाग में लक्ष्यों की कम संख्या इन विधियों की सीमा है 5,6। पिछले कई वर्षों में, मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस, बारकोडिंग फ्लोरेसेंस इमेजिंग और इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन के लिए मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियां एक ही ऊतक अनुभाग 7 का उपयोग करके एक साथ मार्कर धुंधला होने के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए व्यापक रणनीतियों के रूप में उभरीहैं।
यहां हम एक ऐसी तकनीक प्रस्तुत करते हैं जो धातु टैग किए गए एंटीबॉडी और माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री को जोड़ती है और सिंगल-सेल रिज़ॉल्यूशन परिमाणीकरण, मार्कर सह-अभिव्यक्ति (फेनोटाइपिंग), और फॉर्मलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई), और ताजा जमे हुए (एफएफ) ऊतक नमूने 8,9 का उपयोग करके स्थानिक विश्लेषण को सक्षम बनाती है। एफएफपीई नमूने ऊतक संग्रह नमूनों के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली सामग्री हैं और ताजा जमे हुए नमूनों की तुलना में मल्टीप्लेक्स इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के लिए अधिक आसानी से उपलब्ध संसाधन का प्रतिनिधित्व करते हैं10. इसके अतिरिक्त, यह तकनीक महीनों बाद छवियों को पुनः प्राप्त करने की संभावना प्रदान करती है। यहां, हम एफएफपीई ऊतक नमूनों का उपयोग करके हमारे धुंधला और छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल पर चर्चा करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक टीएमई के कई घटकों के बीच जटिल, जटिल बातचीत का व्यापक स्पष्टीकरण कैंसर अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण उद्देश्य बना हुआ है। निर्माताओं ने इस प्रयास के हिस्से के रूप में कई मल्टीप्लेक्स परख पेश किए हैं, खास?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक इस लेख को संपादित करने के लिए संपादन सेवाओं, एमडी एंडरसन में रिसर्च मेडिकल लाइब्रेरी और एमडी एंडरसन में ट्रांसलेशनल मॉलिक्यूलर पैथोलॉजी विभाग में मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस और छवि विश्लेषण प्रयोगशाला से डॉन नॉरवुड को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन के परिणामस्वरूप टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर कैंसर इम्यून मॉनिटरिंग एंड एनालिसिस सेंटर (सीआईएएमएसी) को नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) सहकारी समझौते (यू 24 सीए 224285) के माध्यम से प्रदान किए गए कैंसर इम्यून मॉनिटरिंग एंड एनालिसिस सेंटर-कैंसर इम्यूनोलॉजिकल डेटा कॉमन्स नेटवर्क (सीआईएएमएसी-सीआईडीसी) के लिए वैज्ञानिक और वित्तीय सहायता द्वारा सुविधाजनक अनुसंधान का हिस्सा था।
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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