Summary
El protocolo presenta un modelo de ratón de colonización vaginal con bacterias vaginales humanas cultivadas anaeróbicamente. Nos centramos en Gardnerella vaginalis, al tiempo que incluimos sugerencias para Prevotella bivia y Fusobacterium nucleatum. Este protocolo también se puede utilizar como guía para las inoculaciones vaginales y la recuperación viable de otras bacterias cultivadas anaeróbicamente.
Abstract
La vagina de los mamíferos puede ser colonizada por muchos taxones bacterianos. El microbioma vaginal humano a menudo está dominado por especies de Lactobacillus , pero una de cada cuatro mujeres experimenta vaginosis bacteriana, en la que un bajo nivel de lactobacilos se acompaña de un crecimiento excesivo de diversas bacterias anaeróbicas. Esta condición se ha asociado con muchas complicaciones de salud, incluidos los riesgos para la salud reproductiva y sexual. Si bien existe una creciente evidencia que muestra la naturaleza compleja de las interacciones microbianas en la salud vaginal humana, los roles individuales de estas diferentes bacterias anaeróbicas no se comprenden completamente. Esto se complica por la falta de modelos adecuados para estudiar las bacterias vaginales cultivadas anaeróbicamente. Los modelos de ratón nos permiten investigar la biología y virulencia de estos organismos in vivo. Otros modelos de ratón de inoculación bacteriana vaginal han sido descritos previamente. Aquí, describimos métodos para la inoculación de bacterias cultivadas anaeróbicamente y su recuperación viable en ratones C57Bl/6 criados convencionalmente. También se describe un nuevo método de procedimiento menos estresante para la inoculación y el lavado vaginal. La inoculación y la recuperación viable de Gardnerella se describen en detalle, y se discuten estrategias para anaerobios adicionales como Prevotella bivia y Fusobacterium nucleatum .
Introduction
En los mamíferos, la vagina es el hogar de un consorcio de especies bacterianas. El microbioma vaginal humano es único entre los mamíferos en su abundancia de miembros del género Lactobacillus y el correspondiente pH vaginal bajo (3.8-4.5)1,2,3,4. La interrupción de esta dominancia de Lactobacillus se asocia con una variedad de resultados negativos para la salud.
En la vaginosis bacteriana (VB) hay menos lactobacilos y una mayor abundancia de diversas bacterias anaeróbicas, como Gardnerella vaginalis y Prevotella bivia 5,6. Las mujeres con VB tienen un mayor riesgo de infecciones de transmisión sexual 7,8,9, infertilidad 10, pérdidas de embarazo 11, parto prematuro 12,13,14, infecciones intrauterinas 15, infecciones cervicales 16 y cáncer16,17,18 . La VB también se asocia con una mayor probabilidad de colonización vaginal por bacterias potencialmente patógenas, como Fusobacterium nucleatum 1,19,20, un aislado común de infecciones del líquido amniótico21.
Debido a la importancia de las bacterias anaeróbicas en la salud vaginal humana, existe la necesidad de modelos animales que puedan usarse para investigar la biología y la patogénesis de estos organismos. Aquí, describimos métodos para la inoculación vaginal y la recuperación viable de Gardnerella vaginalis en ratones estrogenizados y sugerimos estrategias adicionales para Prevotella bivia y Fusobacterium nucleatum. Anteriormente se han descrito otros modelos de colonización vaginal murina, pero estos se han centrado en la inoculación y recuperación de bacterias anaerobias facultativas como Streptococcus22 del grupo B y Neisseria gonorrhoeae23 que se cultivaron aeróbicamente. La inoculación y recuperación de anaerobios obligados se puede lograr con éxito con estrategias experimentales apropiadas. Discutimos enfoques para la recuperación viable de varios taxones bacterianos y sugerimos una evaluación empírica de las condiciones para la viabilidad de especies / cepas adicionales de interés.
El método clásico para estimar la colonización por bacterias vivas es la recuperación de unidades formadoras de colonias (UFC). En ratones criados convencionalmente con su propia microbiota endógena, esto requiere recuperación en medios de agar que seleccionan contra los miembros de la microbiota vaginal endógena mientras permiten que crezca la cepa inoculada de bacterias. Aquí, utilizamos un aislado resistente a la estreptomicina de G. vaginalis24 que se puede recuperar selectivamente en un medio de agar que contiene estreptomicina. Para garantizar que el medio sea suficientemente selectivo y, a la inversa, que las bacterias resistentes a la estreptomicina no estén presentes en el microbioma endógeno, los lavados vaginales recolectados justo antes de la inoculación deben colocarse en agar selectivo (que contenga estreptomicina).
El mejor método para la preparación del inóculo puede variar entre especies y cepas de bacterias. Antes del inicio de los experimentos en ratones, se debe realizar un trabajo preliminar para determinar las condiciones preferibles para el medio de cultivo, el punto final de crecimiento y la preparación del inóculo, así como la susceptibilidad al oxígeno y la viabilidad en PBS. En el caso de bacterias más sensibles al oxígeno, se pueden considerar preparaciones alternativas del inóculo (p. ej., en un medio de cultivo anaeróbico con un grupo de control del vehículo apropiado)25,26.
Protocol
Todos los experimentos con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con las pautas institucionales y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de California en San Diego (UCSD, Protocolo Número: S20057, 2020-en adelante) y antes de eso en la Universidad de Washington, St. Louis (Protocolo 20110149, hasta 2020).
NOTA: El siguiente protocolo utiliza ratones hembra C57Bl / criados convencionalmente, de 6 a 11 semanas de edad en el momento de la inoculación. Tenga en cuenta la información del proveedor y los rangos de edad específicos utilizados anteriormente en el trabajo citado relevante.
1. Preparación y administración de β-estradiol-17-valerato
NOTA: El 17-valerato de β-estradiol es un carcinógeno y una toxina reproductiva que puede ser absorbida a través de la piel27,28. Use el EPP adecuado durante la manipulación de la solución en polvo y líquido. También es una toxina acuática29; Deséchelo adecuadamente en un recipiente debidamente sellado y etiquetado.
- El filtro esterilice hasta 50 ml de aceite de sésamo a través de un filtro de 0,22 μm utilizando un sistema de filtro de vacío de tubo cónico de 50 ml. Abierto solo en un gabinete de bioseguridad para mantener la esterilidad.
- Calcule el volumen de solución de valerato de β-estradiol necesaria para el experimento: 200 μL por ratón más 2-3 ml adicionales para tener en cuenta la pérdida de muestra durante el llenado de la jeringa (por ejemplo, un experimento de 10 ratones requiere 4 ml en total). Calcule la cantidad de valerato de β-estradiol necesaria para hacer una solución de 5 mg/ml y pésela directamente en un tubo de fondo redondo de 14 ml.
- Tapa firmemente el tubo de 14 ml y vórtice para romper los grumos en el polvo (esto permitirá que el valerato de β-estradiol se disuelva más rápidamente). Agregue aceite de sésamo filtrado estéril al tubo de 14 ml para que la concentración final de valerato de β-estradiol sea de 5 mg / ml.
- Coloque el tubo de 14 ml bien tapado en un rotador a 37 °C durante 30-40 min, hasta que el polvo sólido se disuelva por completo. Confirme visualmente la homogeneidad de la solución antes de la inyección en los ratones. La incubación a 37 °C disminuye la viscosidad del aceite de sésamo, lo que facilita su inyección.
- Extraiga la solución de valerato de β-estradiol en una jeringa de 1 ml (sin aguja). Para hacer esto sin introducir burbujas, primero, extraiga un poco de la solución, luego expulse suavemente mientras mantiene la punta de la jeringa en el aceite de sésamo. Vuelva a extraer la solución lentamente, ligeramente más allá de la marca de 100 μL.
- Coloque una aguja de 25 G x 5/8 en la jeringa. Luego, prepare la aguja expulsando lentamente la solución de aceite de sésamo hasta que comience a salir de la punta de la aguja. Expulsar la solución hasta que la jeringa esté en la marca de 100 μL. Prepare una jeringa por ratón.
- Administrar el 17-valerato de β-estradiol por inyección intraperitoneal a las 48 h o 72 h antes de la inoculación. Inyectar a cada ratón 100 μL de la solución de valerato de β-estradiol de 5 mg/ml (0,5 mg de valerato de β-estradiol/ratón), como se describió anteriormente22,30. Conservar la solución restante a 4 °C durante 72 h hasta la siguiente inyección.
- Administrar la solución de valerato de β-estradiol nuevamente el día de la inoculación, inmediatamente antes de la inoculación vaginal de los ratones. Retirar la solución a 4 °C y colocarla sobre un rotador a 37 °C durante 30 minutos antes de la inyección para permitir que el aceite de sésamo se caliente y se vuelva menos viscoso. Proceda con las inyecciones como se describe en el paso 1.7.
2. Preparación del inóculo
NOTA: Esta sección contiene los pasos generales para la preparación de inóculos a partir de Gardnerella vaginalis resistente a la estreptomicina cultivada anaeróbicamente JCP8151B-SmR 24,25,31,32. Todos los pasos de esta sección deben realizarse en una cámara anaeróbica.
- Cicle cualquier reactivo, incluido el caldo NYC III, agar y PBS preparados, en una cámara anaeróbica para equilibrarse al menos 24 horas antes de su uso.
NOTA: Aquí se utilizó una cámara anaeróbica de vinilo equilibrada con una mezcla de gas hidrógeno al 5%. La concentración interna de oxígeno generalmente descansa en 0 ppm, aunque puede haber aumentos transitorios de bajo nivel (10-25 ppm) cuando se ciclan materiales en la cámara. - Dos días antes de la inoculación vaginal, extraiga Gardnerella de un stock de glicerol congelado en una placa de agar NYC III en la cámara anaeróbica. Use un recipiente pequeño (como una caja de punta de pipeta vacía) lleno de hielo seco para mantener el stock de glicerol congelado durante el transporte dentro y fuera de la cámara.
- 1 día antes de la inoculación vaginal, use 5-10 colonias individuales de Gardnerella de la placa para inocular 10 ml de caldo NYC III. Dejar crecer el cultivo líquido durante la noche durante 16 h a 37 °C. Incluir una segunda alícuota de 1 ml del medio de cultivo que se deja sin inocular e incubarlo junto con el cultivo inoculado para confirmar que el medio no está contaminado.
- Preparar el inóculo a partir de cultivo líquido como se describe a continuación. Realizar la preparación del inóculo en la cámara anaeróbica tanto como sea posible.
- Determinar la densidad óptica (OD) del cultivo añadiendo 200 μL de cultivo a 800 μL de medios frescos en una cubeta de 1,5 ml (dilución 1:5). Use un espectrofotómetro para medir la densidad (OD) del cultivo diluido a una longitud de onda de 600 nm (use una cubeta separada con medios frescos solo como espacio en blanco). Multiplique la lectura de OD por 5 para obtener el OD600 real del cultivo de 16 h.
- Calcule el volumen de inóculo necesario para el experimento. Por ejemplo, para infectar a 15 ratones con un inóculo de 20 μL por ratón, se necesitan 15 x 20 μL = 300 μL de inóculo. Prepare aproximadamente un 25% más de inóculo del necesario, por lo que para 15 ratones, prepare 300 μL + (0.25 x 300 μL) = 375 μL de inóculo.
- Utilizando el OD 600 determinado en el paso 2.4.1., calcule el volumen del cultivo de 16 h que debe hilarse y resuspenderse para obtener un inóculo OD600 = 5.0 en el volumen calculado en el paso 2.4.2. Por ejemplo, si el OD600 del cultivo es 1,5, y el volumen de inóculo necesario es 375 μL, entonces el volumen de cultivo a hilar es (375 μL x 5)/1,5 = 1250 μL.
- Pipetear el volumen de cultivo calculado en el paso 2.4.3. en un tubo de microcentrífuga estéril. Granular las bacterias centrifugando a 16.000 x g durante 1-3 min.
- Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en PBS anaeróbico al volumen calculado en el paso 2.4.2. El inóculo estará ahora en un ODcalculado 600 de 5.0. Si corresponde, también prepare un tubo de PBS para que sirva como control del vehículo para ratones en el grupo de control no infectado.
- Antes de retirar el tubo de inóculo de la cámara anaeróbica, prepare una serie de dilución en serie de 1:10 a 1:10 x 106 en PBS. La placa puntual 5 replica cada dilución en una placa de agar utilizando una pipeta multicanal para determinar la UFC del inóculo. Esta es la UFC previa a la inoculación.
3. Prelavado vaginal e inoculación con Gardnerella
- Preparar tubos vaginales de lavado/lavado en la cámara anaeróbica (esto se puede hacer al mismo tiempo que la preparación del inóculo en el paso 2.4.). Pipetear 70 μL de PBS anaeróbico estéril en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml marcados con números de ratón. Prepare un tubo de lavado por ratón. Cierre herméticamente los tubos y sáquelos de la cámara anaeróbica.
- Realizar un lavado vaginal en cada ratón con PBS anaeróbico de 50 μL de los tubos individuales preparados en el paso 3.1. Estos lavados vaginales son los lavados previos a la inoculación y se pueden usar para mediciones y ensayos posteriores.
- Después de la administración de la segunda inyección de valerato de β-estradiol (paso 1.8), coloque cada ratón encima de una jaula o una superficie dura limpia que pueda agarrar con sus patas delanteras. Agarre suavemente la parte media de la cola y levántela para que los cuartos traseros estén ligeramente elevados y la abertura vaginal quede expuesta.
- Con una pipeta y una punta de filtro p-200, extraer 50 μL de PBS del tubo de lavado correspondiente al ratón apropiado. Inserte suavemente la punta de la pipeta en la luz vaginal ~2-3 mm, y pipete el volumen de 50 μL hacia adentro y hacia afuera suavemente, 3x-4x.
- Transfiera el material de lavado recolectado (~ 50 μL) nuevamente al mismo tubo de lavado del que proviene, pipeteando hacia arriba y hacia abajo en el tubo de lavado que aún contiene los 20 μL restantes de PBS. Si hay exceso de moco y la punta se obstruye, use una punta p-200 limpia para recoger el material restante y colóquelo en el mismo tubo de lavado.
- Administrar por vía vaginal 20 μL de la suspensión bacteriana concentrada o control del vehículo en la vagina de cada ratón. Inocular a cada ratón inmediatamente después del lavado vaginal para ese ratón (es decir, realizar el lavado y la inoculación en secuencia para cada ratón antes de pasar al siguiente). Para simplificar este proceso, utilice dos pipetas p200: una ajustada a 50 μL para lavados y la otra a 20 μL para inoculaciones.
- Sujete el ratón como se describe en el paso 3.2.1. Usando una punta p-200, pipetear 20 μL de suspensión bacteriana en la vagina. Para experimentos de coinoculación con dos especies/cepas bacterianas diferentes, use 10 μL de cada suspensión bacteriana y evite mezclar las dos cepas antes de la inoculación.
NOTA: El volumen total de inoculación no debe exceder los 20 μL para evitar que la vagina se extienda. - Continúe sosteniendo el extremo trasero de cada ratón durante 10-20 s para evitar que el volumen administrado se acumule inmediatamente en el introito vaginal. Luego, coloque al ratón en una nueva jaula / receptáculo o con compañeros de jaula que ya hayan sido inoculados.
- Repita el paso 3.2. y paso 3.3. para cada ratón. Nunca vuelva a colocar ratones en una jaula con animales que aún no hayan sido inoculados. Esto evita la exposición inadvertida de ratones a bacterias resistentes a la estreptomicina antes de la inoculación.
- Sujete el ratón como se describe en el paso 3.2.1. Usando una punta p-200, pipetear 20 μL de suspensión bacteriana en la vagina. Para experimentos de coinoculación con dos especies/cepas bacterianas diferentes, use 10 μL de cada suspensión bacteriana y evite mezclar las dos cepas antes de la inoculación.
- Después de que todos los ratones hayan sido inoculados, cicle el tubo de inóculo de nuevo en la cámara anaeróbica. Preparar y emplatar otra dilución seriada como se describe en el paso 2.5. Esta es la UFC posterior a la inoculación. Compare las UFC de las placas posteriores a la inoculación y a la inoculación para determinar si la viabilidad del inóculo disminuyó mientras estaba fuera de la cámara anaeróbica durante la inoculación de los animales.
- Colocar en placa los lavados vaginales recogidos en el paso 3.2. en agar selectivo (en este caso, 1 mg/ml de estreptomicina). Incubar las placas durante 1-2 días en una cámara anaeróbica a 37 °C y examinar el crecimiento.
NOTA: El crecimiento indica que los miembros endógenos del microbioma son resistentes al marcador de selección y, por lo tanto, pueden oscurecer la enumeración de UFC del organismo objetivo.
4. Recolección de lavados vaginales para determinar la colonización viable de Gardnerella
- Recoja los lavados vaginales en puntos de tiempo seleccionados para analizar la colonización vaginal. Recopile como se describe en el paso 3.2.
- Inmediatamente después de la recolección, cicle los lavados vaginales en una cámara anaeróbica. Utilizar 10 μL de cada lavado para realizar la dilución en serie y el recubrimiento en agar selectivo como se describe en el paso 2.5. Use los recuentos de UFC como una medida de colonización vaginal por Gardnerella (u otro anaerobio de interés).
5. Sacrificio, disección y homogeneización de tejidos
- Prepare un tubo de 5 ml para cada órgano que se recolecte de cada ratón (por ejemplo, si se están recolectando la vagina, el cuello uterino y el útero, prepare tres tubos por ratón). Llene cada tubo con 1x PBS anaeróbico estéril (u otro medio de homogeneización) en la cámara anaeróbica. Use 1 ml de PBS para los tubos utilizados para recolectar vaginas y cervices y 750 μL para los tubos utilizados para recolectar cuernos uterinos.
- Una vez que se agrega PBS, pese cada tubo individual (este es el peso previo a la recolección y se usará para determinar el peso total de cada tejido cosechado). Si no hay una báscula disponible en la cámara anaeróbica, tape firmemente los tubos y sáquelos de la cámara para pesarlos, luego vuelva a colocarlos.
NOTA: La preparación del tubo y la recolección de peso se pueden hacer 1 día antes del sacrificio, pero los tubos deben mantenerse en la cámara anaeróbica con tapas herméticamente selladas para evitar la evaporación. - Prepare un conjunto de tubos de lavado vaginal como se describe en el paso 3.1. para recoger el lavado final en el sacrificio. Además, prepare un vaso de precipitados de 50 ml de agua desionizada (DI) y un segundo vaso de precipitados de 50 ml de etanol al 70% -90% para usar en el enjuague y esterilización de instrumentos de disección de acero estándar durante el sacrificio.
- Cicle los tubos de recolección de órganos llenos de PBS de la cámara anaeróbica. Mantenga los tubos bien cerrados hasta que los tejidos estén listos para ser agregados.
- Sacrifique cada ratón utilizando métodos aprobados por IACUC. Realice el lavado final como se describe en los pasos 3.2.2. y 3.2.3. ya sea inmediatamente antes del sacrificio o inmediatamente después.
- Comience la disección y la recolección de tejidos. Rocíe el abdomen y la parte posterior de cada ratón con etanol al 70%. Esterilice las tijeras en un vaso de precipitados de etanol, déjelas secar y luego haga un solo corte vertical en la cavidad abdominopélvica del ratón.
- Use fórceps estériles para retirar la piel y empuje suavemente los intestinos fuera de la cavidad del cuerpo y hacia el lado del campo abierto, lo que expondrá el tracto reproductivo.
NOTA: Tenga cuidado de no perforar o perforar los intestinos, ya que pueden albergar bacterias resistentes a la estreptomicina que pueden confundir los resultados experimentales. - Para recolectar el tejido vaginal máximo, rompa el hueso púbico durante la necropsia. Usando tijeras estériles, corte el centro del hueso púbico (la sínfisis púbica) teniendo cuidado de no cortar la vagina. Usando dos juegos de fórceps estériles, agarre cada lado de la pelvis y abra la pelvis lateralmente, exponiendo la parte inferior de la vagina debajo.
- Use fórceps para agarrar suavemente el cuello uterino (una estructura más dura en comparación con el tejido circundante). Tire suavemente hacia arriba del cuello uterino para exponer el colon, oculto detrás y estrechamente conectado a la vagina.
- Use tijeras pequeñas para liberar la vagina de los tejidos conectivos externos. Separe cuidadosamente la vagina del colon y evite perforar el tracto intestinal. Cuando esté completamente liberado, flanquee la vagina en el introito con tijeras y corte para liberar del cuerpo del ratón.
- Mantenga un agarre suave en el cuello uterino mientras tira ligeramente hacia arriba para que los cuernos uterinos sean más visibles. Con la otra mano, corte directamente debajo de los ovarios en los lados derecho e izquierdo para liberar los cuernos uterinos. Retire el tracto reproductivo ahora desconectado de la cavidad corporal y colóquelo en una placa de Petri estéril.
- Con una navaja de afeitar, separe los cuernos uterinos, el cuello uterino y la vagina. Coloque cada tejido en su respectivo tubo de recolección etiquetado. Si se van a recolectar citoquinas, coloque los tubos en hielo después de la adición de tejido.
- Pese cada tubo nuevamente después de que se haya agregado el tejido. Este es el peso posterior a la recolección. Reste el peso previo a la recolección del peso posterior a la recolección para obtener el peso total del tejido.
- Use un homogeneizador de mano para homogeneizar los órganos en sus tubos de recolección. Para Gardnerella JCP8151B, realice este paso en el gabinete de bioseguridad (aeróbicamente) o en la cámara anaeróbica.
- Prepare varios juegos de tubos para el lavado y el tratamiento aséptico del homogeneizador manual entre muestras. Asegúrese de que cada conjunto tenga tres tubos cónicos de 50 ml: uno lleno de agua DI, uno con etanol al 70% y el tercero con 1x PBS. Prepare un juego separado de tubos de lavado para cada grupo de tratamiento con ratones.
- Para limpiar el homogeneizador, baje las cuchillas en el líquido en cada tubo de lavado y gire el instrumento a la velocidad máxima. Mantenga el homogeneizador en cada uno de los tres tubos durante aproximadamente 3 s. El orden de lavado es agua DI (para eliminar desechos físicos), luego etanol (para desinfectar) y finalmente 1x PBS (para neutralizar). Agite la sonda sobre una toalla de papel o una almohadilla desechable para eliminar el exceso de líquido entre cada enjuague.
- Después del enjuague inicial, homogeneice los tejidos bajando la sonda homogeneizadora hasta el fondo del tubo de recolección, atrapando el tejido debajo. Encienda el homogeneizador para moler el tejido, moviendo suavemente la sonda hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5 veces mientras permanece sumergida. Homogeneizar cada órgano durante unos 15-30 s.
- Después de apagar y retirar el homogeneizador del tubo, inspeccione visualmente el contenido para garantizar una interrupción completa del tejido. Esto es especialmente importante para el cuello uterino y la vagina, que a veces no pueden ser atrapados por la sonda.
NOTA: Está bien si un poco de exceso de grasa en los cuernos uterinos no homogeneiza completamente. - Repita los pasos 5.14.1.-5.14.4., lavando y esterilizando la sonda entre cada muestra. Cambie a un nuevo juego de tubos de lavado para cada grupo experimental.
- Mover los tubos con muestras homogeneizadas a la cámara anaeróbica. Para determinar la carga bacteriana de cada tejido, realice un breve vórtice suave de la muestra a mezclar, luego retire 100 μL de homogeneizado de tejido para dilución en serie y recubrimiento en agar selectivo para la determinación de UFC (la primera dilución es 1 x 100). Si se requiere un límite inferior de detección, realice un recubrimiento extendido de 200-250 μL de homogeneizado sin diluir.
Representative Results
Una representación esquemática de un experimento de ejemplo muestra algunas de las formas en que uno podría llevar a cabo el protocolo descrito (Figura 1).
Algunos animales portarán microbios endógenos en sus microbiomas vaginales que crecerán en medios no selectivos. Los métodos descritos aquí se basan en aislados resistentes a la estreptomicina de las cepas bacterianas estudiadas, junto con medios selectivos que contienen estreptomicina, para seleccionar contra bacterias endógenas (Figura 2A, B). Es posible que la resistencia a la estreptomicina se desarrolle espontáneamente, por lo que revisar a los ratones antes de la infección (lavado del día 0) puede ayudar a establecer si esto puede ser un problema.
La recuperación de bacterias viables de los lavados vaginales se logra mediante dilución en serie y chapado en medios de agar. Una placa de Petri estándar puede contener hasta una matriz de 6 x 6 de manchas de 5 μL, lo que permite la enumeración de títulos bacterianos de seis puntos de réplica en seis órdenes de magnitud para cada muestra si se utilizan diluciones en serie de 10 veces (Figura 3A). Este método se puede utilizar para enumerar los títulos de bacterias que van desde Gardnerella hasta Prevotella y Fusobacterium (Figura 3B-D).
Juntos, estos métodos permiten probar hipótesis y hacer interpretaciones sobre la colonización bacteriana / infección del tracto reproductivo femenino. Por ejemplo, una comparación de los títulos de Gardnerella en lavados vaginales y homogeneizados de tejido vaginal demostró concordancia entre estos métodos (Figura 4A). Del mismo modo, en un modelo de coinoculación vaginal, los títulos de Prevotella en el tejido uterino fueron significativamente mayores (aproximadamente 20 veces) durante la coinfección por Gardnerella en comparación con la monoinfección por Prevotella (Figura 4B). Finalmente, las cepas bacterianas de tipo salvaje versus mutantes se pueden comparar en estos modelos para establecer el papel desempeñado por genes específicos y sus productos en los procesos de colonización / infección del tracto reproductivo. Por ejemplo, una cepa mutante de Fusobacterium que carecía de la capacidad de transportar y consumir el ácido siálico de carbohidratos condujo a niveles más bajos de colonización a los 3 días posteriores a la inoculación (Figura 4C).
Figura 1: Esquema de un experimento de ejemplo33. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Crecimiento de microbios vaginales murinos endógenos en agar selectivo versus no selectivo. Los lavados vaginales de cinco ratones hembra C57Bl/6 (1-5) se rayaron en dos placas diferentes de agar NYC III y se incubaron anaeróbicamente. (A) La placa de la izquierda no contiene antibióticos y permite el crecimiento de bacterias anaerobias endógenas del tracto vaginal murino. (B) La placa de la derecha contiene 1 mg/ml de estreptomicina y selecciona contra el crecimiento de bacterias endógenas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Recuperación de UFC viables de G. vaginalis, P. bivia y F. nucleatum a partir de lavados vaginales. (A) UFC del inóculo JCP8151B-SmR de G. vaginalis, revestido como una serie de dilución en agar NYC III. (B-D) Recuperación de (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 y (D) F. nucleatum26 viables de los lavados vaginales de animales monoinfectados. Para cada gráfico (B-D), los datos se combinan de dos experimentos independientes, con 10-15 ratones por experimento24,25,26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis adicional de la colonización bacteriana anaeróbica en un modelo murino de inoculación vaginal. (A) Los títulos de G. vaginalis en lavados vaginales se correlacionan con los títulos de G. vaginalis recuperados de homogeneizados de tejido vaginal a las 24 h y 72 h después de la inoculación (combinación de dos experimentos independientes, n = 10 cada uno. Significación determinada por la prueba de correlación de rangos de Spearman)24. (B) La coinfección con G. vaginalis conduce a un aumento de los títulos de P. bivia en el tejido del cuerno uterino en comparación con los animales monoinfectados por P. bivia a las 48 h después de la inoculación (combinación de dos experimentos independientes, cada uno con 6-10 ratones por grupo. Significancia determinada por la prueba U de Mann-Whitney, **p = 0,0017)25. (C) El mutante de F. nucleatum con transportador de ácido siálico interrumpido (Ω SiaT) ha disminuido los títulos en lavados vaginales de ratones monoinfectados en comparación con F. nucleatum de tipo salvaje a las 72 h después de la inoculación (combinación de dos experimentos independientes, cada uno con 10 ratones por grupo. Significancia determinada por la prueba U de Mann-Whitney, **p < 0,01)26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Ejemplos de métodos utilizados para diferentes bacterias vaginales cultivadas en condiciones anaeróbicas. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
La forma más significativa en que el modelo descrito aquí difiere de los modelos de inoculación vaginal publicados anteriormente es el uso de bacterias cultivadas anaeróbicamente, que requieren consideraciones especiales para la preparación de inóculo viable y la recuperación de bacterias de los ratones. Los pasos específicos en el protocolo anterior pueden variar ligeramente dependiendo de la especie/cepa de bacterias utilizada, como se sugiere en el Archivo Suplementario 1. Además, este manuscrito describe un nuevo método de procedimiento para la administración de bacterias y lavados vaginales que requiere menos experiencia por parte del investigador y menos restricción para los ratones. Si el experimentador no se siente cómodo con la forma de restricción descrita en el paso 3.2. y paso 3.3., los ratones pueden ser desaliñados como se describió anteriormente34 con o sin anestesia de acuerdo con el diseño experimental y las directrices institucionales de IACUC.
Una advertencia importante para el uso de bacterias cultivadas anaeróbicamente en modelos murinos es que ciertos pasos (como los que involucran animales vivos) deben realizarse fuera de la cámara anaeróbica. Por lo tanto, los pasos más críticos en este protocolo son aquellos en los que las bacterias de interés estarán expuestas a un ambiente aeróbico, como durante la inoculación de los ratones. El uso de cualquier anaerobio nuevo en este modelo requerirá una investigación preliminar sobre su capacidad para mantener la viabilidad tras la exposición al oxígeno (como la comparación de UFC antes y después de la inoculación como se describe en el paso 2.5. y el paso 3.4.). Dependiendo del grado de sensibilidad al oxígeno y al PBS del organismo, se deben considerar diferentes métodos de preparación del inóculo (Archivo complementario 1, paso 2.4.5.). Para las inoculaciones con G. vaginalis JCP8151B, hemos encontrado que se puede preparar un solo tubo de inóculo en PBS y usarse para infectar a todos los ratones. Si se utiliza una bacteria anaeróbica diferente que es más sensible al oxígeno, el inóculo se puede preparar en tubos separados para cada ratón, de modo que no sea necesario abrir / cerrar repetidamente el tubo. Del mismo modo, si la especie bacteriana de interés es más exigente / menos capaz de sobrevivir en PBS que G. vaginalis, la inoculación puede prepararse en medios de cultivo. Si el medio utilizado contiene agentes reductores, como el medio anaerobio CDC utilizado para cultivar Prevotella bivia (Archivo complementario 1, paso 2.1. y paso 2.2.), entonces las bacterias también tendrán una mayor protección contra la exposición al oxígeno.
También se pueden considerar métodos alternativos para la homogeneización, como el batido de perlas22,35, que se realiza con la tapa del tubo cerrada y, por lo tanto, puede introducir menos oxígeno que el homogeneizador de mano. Además, los organismos más sensibles al oxígeno pueden requerir un tiempo de equilibrio más largo para los medios. Se puede utilizar un indicador de oxígeno como la resazurina para comprobar que se han alcanzado las condiciones anaeróbicas (paso 2.1.). Los métodos alternativos, como los frascos anaeróbicos, pueden afectar los resultados y deben examinarse para determinar su viabilidad bacteriana antes de su uso.
La sensibilidad al oxígeno y la meticulosidad del organismo experimental también pueden desempeñar un papel en la recuperación exitosa de bacterias viables del ratón durante los lavados / homogeneización (Archivo complementario 1, paso 3.2. y paso 5.1.). Para organismos altamente sensibles, el tiempo entre el lavado que se toma y el plateado puede conducir a una pérdida de viabilidad y causar una estimación artificialmente baja de la colonización vaginal bacteriana. Para mitigar este efecto, los lavados recolectados se pueden diluir inmediatamente en medios de cultivo anaeróbicos frescos (con agente reductor). Del mismo modo, la homogeneización de órganos se puede hacer en medios de cultivo frescos en lugar de PBS para aumentar la viabilidad bacteriana y también se puede hacer en la propia cámara anaeróbica para minimizar la exposición al oxígeno.
Dependiendo del propósito de un experimento dado, el experimentador debe prestar atención a los grupos de control. Para probar hipótesis, las medidas basales de ratones de control no infectados que son tratados simuladamente solo con vehículo ayudarán a establecer si hay inducción de quimiocinas / citoquinas u otros resultados específicos de la infección. El vehículo de control utilizado debe ser el mismo que el vehículo utilizado para la inoculación, por lo que si las bacterias se inoculan en medios de cultivo, deben utilizarse medios de cultivo no inoculados como control (Archivo complementario 1, paso 2.4.5.).
Los métodos descritos en este protocolo también podrían aplicarse a bacterias facultativas capaces de crecer anaeróbicamente pero que tradicionalmente se estudian utilizando condiciones de cultivo aeróbico (como Escherichia coli o Streptococcus del grupo B). Esto podría ser especialmente relevante para las infecciones por estos organismos en sitios del cuerpo que se cree que contienen bajos niveles de oxígeno, como el cuello uterino. Puede ser que un organismo facultativo infecte con más éxito los sitios con menos oxígeno cuando el inóculo se prepara anaeróbicamente en comparación con aeróbicamente. En tal experimento, la recuperación de bacterias viables para la enumeración de UFC puede no requerir condiciones anaeróbicas.
Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a Lynne Foster por su asistencia técnica durante el desarrollo de estos modelos. Apreciamos los fondos iniciales del Departamento de Microbiología Molecular y el Centro para la Investigación de Enfermedades Infecciosas de la Mujer (a AL), y March of Dimes (premio Basil O'Connor a AL) que ayudaron a apoyar experimentos en etapa inicial. El Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (R01 AI114635) también apoyó el desarrollo de estos modelos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-estradiol 17-valerate | Sigma | E1631 | estrogenization of mice |
| 0.22 µm, 50 mL Steriflip vacuum filter | Fisher | SCGP00525 | sterile filtering sesame oil |
| 14 mL tube | Falcon | 352059 | estrogenization of mice |
| 190-proof ethanol | Koptec | V1105M | dissection, tissue homogenization, CDC and Columbia media |
| 1x PBS | Fisher | MT21040CM | vaginal lavage, G. vaginlalis inoculum prep, tissue collection and homogenization |
| 25 G × 5/8 -in needle | BD | 305122 | estrogenization of mice |
| 5 mL tube | Falcon | 352063 | Tissue collection and homogenization |
| Anaerobic chamber | Coy | 7200000 | Growth of anaerobic bacteria |
| Bacto agar | Fisher | DF0140074 | G. vaginalis, F. nucleatum, and P. bivia agar plates |
| Bacto peptone | Fisher | DF0118170 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Columbia broth | Fisher | DF0944170 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Defibrinated sheep blood | Hemostat | DSB500 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | mouse/tissue dissection |
| Glucose | Sigma | G7528 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Handheld homogenizer | ISC Bio | 3305500 | Tissue homogenization |
| Hemin | Sigma | 51280 | CDC anaerobic media for P. bivia growth, Columbia media for F. nucleatum growth |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Horse serum | Hemostat | SHS500 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Hydrogen gas mix (5% hydrogen, 10% CO2, 85% nitrogen) | Matheson | Gas for anaerobic chamber | |
| Isofluorane | VetOne | 502017 | mouse anaethesia at sacrifice |
| L-cysteine | Sigma | C1276 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| L-glutamate | Sigma | G1626 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Milli-Q Water Purifier | Millipore | IQ-7000 | for making media and homogenization |
| NaCl | Sigma | S3014 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| NaOH tablets | Sigma | S5881 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Nitrogen gas | Airgas | Gas for anaerobic chamber | |
| p-200 filter tips | ISC Bio | P-1237-200 | vaginal lavages and bacterial inoculations |
| pancreatic digest of casein | Sigma | 70169 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Proteose peptone #3 | Fisher | DF-122-17-4 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
| Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | mouse/tissue dissection |
| Sesame oil | Fisher | ICN15662191 | estrogenization of mice |
| Single edge surgical carbon steel razor blades | VWR | 55411-050 | tissue dissection |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Spectrophotometer | BioChrom | 80-3000-45 | measuring bacterial OD600 |
| Streptomycin | Gibco | 11860038 | add to agar media to make selective plates |
| Tuberculin slip tip 1ml syringe | BD | 309659 | estrogenization of mice |
| Vitaim K3 | Sigma | M5625 | Columbia media for F. nucleatum growth |
| Vitamin K1 | Sigma | 95271 | CDC anaerobic media for P. bivia growth |
| Yeast extract | Fisher | DF0127-17-9 | NYCIII media for G. vaginalis growth |
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