En ny ex vivo-sårmodell med hög genomströmning för får för testning av nya antibiotika
Summary
Protokollet beskriver en steg-för-steg-metod för att sätta upp en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus. Denna modell med hög genomströmning simulerar bättre infektioner in vivo jämfört med konventionella mikrobiologiska tekniker och ger forskare en fysiologiskt relevant plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel.
Abstract
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en dyr process med allt lägre framgångsgrad, vilket gör ytterligare investeringar i forskning om upptäckt av antimikrobiella medel mindre attraktiva. Antimikrobiell läkemedelsupptäckt och efterföljande kommersialisering kan göras mer lukrativ om en misslyckad-snabb-och-misslyckas-billig strategi kan implementeras inom de ledande optimeringsstadierna där forskare har större kontroll över läkemedelsdesign och formulering. I den här artikeln beskrivs installationen av en ex vivo fårskadad hudmodell infekterad med Staphylococcus aureus, som är enkel, kostnadseffektiv, hög genomströmning och reproducerbar. Bakteriefysiologin i modellen efterliknar att vid infektion som bakterieproliferation är beroende av patogenens förmåga att skada vävnaden. Upprättandet av sårinfektion verifieras genom en ökning av livskraftiga bakterieantal jämfört med inokulumet. Denna modell kan användas som en plattform för att testa effekten av nya antimikrobiella medel i blyoptimeringsstadiet. Det kan hävdas att tillgången till denna modell kommer att ge forskare som utvecklar antimikrobiella medel en misslyckas-snabbt-och-misslyckas-billigt modell, vilket kommer att bidra till att öka framgångsgraden i efterföljande djurförsök. Modellen kommer också att underlätta minskning och förfining av djuranvändning för forskning och i slutändan möjliggöra snabbare och mer kostnadseffektiv översättning av nya antimikrobiella medel för hud- och mjukdelsinfektioner till kliniken.
Introduction
Hudinfektioner är en viktig global fråga, med stora ekonomiska kostnader för vårdgivare runt om i världen. Utvecklingen av multidrogresistens och biofilmbildning av patogener spelar en nyckelroll i förekomsten av icke-helande sår 1,2,3,4. Som ett resultat av detta är hud- och mjukvävnadsinfektioner en av de vanligaste orsakerna till förlängd sjukhusvistelse och efterföljande återinläggning5. Förseningar i sårläkning är kostsamma för både patienten och vårdgivare, med vissa uppskattningar som tyder på att cirka 6,5 miljoner patienter drabbas årligen i USA. I Storbritannien leder hudinfektioner och tillhörande komplikationer till cirka 75 000 dödsfall årligen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) är en formidabel sårpatogen som ofta isoleras från patientsår 2,7. Graden av uppkomst av multiresistans ökade drastiskt under 2000-talet. Under denna tid var cirka 60% av akuta bakteriella hud- och hudstrukturinfektioner kulturpositiva för meticillinresistenta S. aureus1. Det ökande antalet multiresistenta stammar bland stafylokocker, och faktiskt andra patogener, under de senaste 2 decennierna indikerar ett brådskande behov av snabb utveckling av antibiotika med nya verkningssätt som kan övervinna resistens.
Men sedan början av 2000-talet har antibiotikaupptäcktsprogram dominerats av längre utvecklingstider och låga framgångsgrader, med endast 17% av nya antibiotika som går in i kliniska prövningar i USA som uppnår marknadsgodkännande8. Detta tyder på en skillnad mellan resultat från in vitro-testning av nya antibiotika och deras kliniska resultat. Det kan hävdas att denna skillnad till stor del beror på skillnader i bakteriell fysiologi vid infektioner in vivo och under konventionella mikrobiologiska metoder vid testning av antibiotikas effektivitet i de prekliniska in vitro-stadierna. Därför behövs nya laboratoriemetoder som är mer representativa för bakteriell fysiologi under infektion för att förbättra framgångsgraden i antibiotikaupptäcktsprogram.
Nuvarande metoder för att studera hudinfektioner inkluderar studier på levande djur (t.ex. möss), ex vivo-hudmodeller (t.ex. svin) och 3D-vävnadskonstruerade hudmodeller (t.ex. människa)9,10,11,12. Studier på levande djur är strikt reglerade och har relativt låg genomströmning. I djurmodeller orsakar sår och infektion betydande lidande för djuren och väcker etiska problem. Mänskliga hudmodeller, ex vivo eller vävnadskonstruerade, kräver etiskt godkännande, efterlevnad av lokal och global lagstiftning (lagen om mänsklig vävnad, Helsingforsdeklarationen), och det finns svårigheter att skaffa vävnader, med vissa förfrågningar som tar år att uppfylla13,14. Båda modelltyperna är arbetsintensiva och kräver betydande expertis för att säkerställa experimentell framgång. Vissa nuvarande ex vivo-hudinfektionsmodeller kräver förinokulerade skivor och tillsatser för sårbädden för att möjliggöra infektion; Även om dessa modeller är otroligt användbara finns det begränsningar i infektionsprocessen eftersom tillsatser begränsar användningen av sårbädden som näringskälla10,15,16,17. Modellen som beskrivs i denna studie använder inga tillsatser till sårbädden, vilket säkerställer att infektionspatologin och livskraftiga cellantal är ett resultat av direkt utnyttjande av sårbädden som den enda näringskällan.
Med tanke på behovet av nya laboratoriemetoder har en ny ex vivo-modell med hög genomströmning av hudinfektioner utvecklats för att utvärdera effekten av nya antibiotika. Hudinfektionsstudier står inför många utmaningar-höga kostnader, etiska problem och modeller som inte visar en fullständig bild20,21. Ex vivo-modeller och 3D-explantmodeller möjliggör bättre visualisering av sjukdomsprocessen och den inverkan behandlingar kan ha från en mer kliniskt relevant modell. Här beskrivs installationen av en ny fårhudsmodell, som är enkel, reproducerbar och kliniskt relevant och har hög genomströmning. Fårskinn valdes eftersom får är ett av de stora däggdjur som vanligtvis används för att modellera svar på infektioner in vivo. Dessutom är de lätt tillgängliga från slakterier, vilket säkerställer en stadig tillgång på hud för forskning, och deras slaktkroppar skållas inte, vilket garanterar god vävnadskvalitet. Denna studie använde S. aureus som exempelpatogen; Modellen fungerar dock bra med andra mikroorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av antimikrobiella medel är en viktig men dyr satsning som beräknas kosta cirka 1 miljard dollar och ta cirka 15 år att slutföra. Över 90% av antimikrobiella läkemedelsupptäckter och prekliniska studier av antimikrobiell läkemedelseffekt utförs av akademiska forskare och små till medelstora företag med vanligtvis mindre än 50 anställda22. Dessa team är mycket ekonomiskt begränsade, vilket gör misslyckandet med blymolekyler i senare skeden av translationell forskning ka…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka EPSRC (EP/R513313/1) för finansieringen. Författarna vill också tacka R.B Elliot och Son Abattoir i Calow, Chesterfield, för att ha tillhandahållit lammhuvuden och för att vara så tillmötesgående i de tidiga stadierna av projektet, Kasia Emery för hennes stöd under hela utvecklingen av detta protokoll och Fiona Wright från institutionen för infektion, immunitet och hjärt-kärlsjukdom vid University of Sheffield för att ha bearbetat histologiproverna och varit så otroligt hjälpsamma under hela detta projekt.
Materials
| 24 Well Companion Plate | SLS | 353504 | |
| 4 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7484 | |
| 50 ml centrifuge tubes | Fisher Scientific | 10788561 | |
| 8 mm Biopsy Punch | Williams Medical | D7488 | |
| Amphotericin B solution, sterile | Sigma | A2942 | |
| Colour Pro Style Cordless Hair Clipper | Wahl | 9639-2117X | Hair Clippers |
| Dual Oven Incubator | SLS | OVe1020 | Sterilising oven |
| Epidermal growth factor | SLS | E5036-200UG | |
| Ethanol | Honeywell | 458600-2.5L | |
| F12 HAM | Sigma | N4888 | |
| Foetal bovine serum | Labtech International | CA-115/500 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 15307805 | |
| Hair Removal Cream | Veet | Not applicable | |
| Heracell VIOS 160i | Thermo Scientific | 15373212 | Tissue culture incubator |
| Heraeus Megafuge 16R | VWR | 521-2242 | Centrifuge |
| Homogenizer 220, Handheld | Fisher Scientific | 15575809 | |
| Homogenizer 220, plastic blending cones | Fisher Scientific | 15585819 | |
| Insert Individual 24 well 0.4um membrane | VWR International | 353095 | |
| Insulin, recombinant Human | SLS | 91077C-1G | |
| Medium 199 (MK media) | Sigma | M0393 | |
| Microplate, cell culture Costar 96 well | Fisher Scientific | 10687551 | |
| Multitron | Infors | Not applicable | Bacterial incubator |
| PBS tablets | Sigma | P4417-100TAB | |
| Penicillin-Streptomycin | SLS | P0781 | |
| Plate seals | Fisher Scientific | ESI-B-100 | |
| Safe 2020 | Fisher Scientific | 1284804 | Class II microbiology safety cabinet |
| Scalpel blade number 15 | Fisher Scientific | O305 | |
| Scalpel Swann Morton | Fisher Scientific | 11849002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761-1KG | |
| Toothed Allis Tissue Forceps | Rocialle | RSPU500-322 | |
| Tryptic Soy Agar | Merck Life Science UK Limited | 14432-500G-F | |
| Tryptic Soy Broth | Merck Life Science UK Limited | 41298-500G-F | |
| Vimoba Tablets | Quip Labs | VMTAB75BX |
References
- Claeys, K. C., et al. Novel application of published risk factors for methicillin-resistant S. aureus in acute bacterial skin and skin structure infections. International Journal of Antimicrobial Agents. 51 (1), 43-46 (2018).
- Rahim, K., et al. Bacterial contribution in chronicity of wounds. Microbial Ecology. 73 (3), 710-721 (2017).
- Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. Costs and outcomes in evaluating management of unhealed surgical wounds in the community in clinical practice in the UK: A cohort study. BMJ Open. 8 (12), 022591 (2018).
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
- Wilcox, M. H., Dryden, M. Update on the epidemiology of healthcare-acquired bacterial infections: Focus on complicated skin and skin structure infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 76, (2021).
- Han, G., Ceilley, R. Chronic wound healing: A review of current management and treatments. Advances in Therapy. 34 (3), 599-610 (2017).
- Percival, S. L., Hill, K. E., Malic, S., Thomas, D. W., Williams, D. W. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 1-9 (2011).
- Dheman, N., et al. An analysis of antibacterial drug development trends in the United States, 1980-2019. Clinical Infectious Diseases. 73 (11), 4444-4450 (2021).
- MacNeil, S., Shepherd, J., Smith, L. Production of tissue-engineered skin and oral mucosa for clinical and experimental use. Methods in Molecular Biology. 695, 129-153 (2011).
- Yang, Q., et al. Development of a novel ex vivo porcine skin explant model for the assessment of mature bacterial biofilms. Wound Repair and Regeneration. 21 (5), 704-714 (2013).
- Malachowa, N., Kobayashi, S. D., Lovaglio, J., Deleo, F. R. Mouse model of Staphylococcus aureus skin infection. Methods in Molecular Biology. 1031, 109-116 (2013).
- Brandenburg, K. S., Calderon, D. F., Kierski, P. R., Czuprynski, C. J., Mcanulty, J. F. Novel murine model for delayed wound healing using a biological wound dressing with Pseudomonas aeruginosa biofilms. Microbial Pathogenesis. 122, 30-38 (2018).
- Bledsoe, M. J., Grizzle, W. E. The use of human tissues for research: What investigators need to know. Alternatives to Laboratory Animals. , (2022).
- Danso, M. O., Berkers, T., Mieremet, A., Hausil, F., Bouwstra, J. A. An ex vivo human skin model for studying skin barrier repair. Experimental Dermatology. 24 (1), 48-54 (2015).
- Torres, J. P., et al. Ex vivo murine skin model for B. burgdorferi biofilm. Antibiotics. 9 (9), 1-18 (2020).
- Zhao, G., et al. Delayed wound healing in diabetic (db/db) mice with Pseudomonas aeruginosa biofilm challenge: A model for the study of chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 18 (5), 467-477 (2010).
- Schierle, C. F., Dela Garza, M., Mustoe, T. A., Galiano, R. D. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound Repair and Regeneration. 17 (3), 354-359 (2009).
- Trøstrup, H., et al. Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model. Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).
- Thompson, M. G., et al. Evaluation of gallium citrate formulations against a multidrug-resistant strain of Klebsiella pneumoniae in a murine wound model of infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (10), 6484-6493 (2015).
- Maboni, G., et al. A novel 3D skin explant model to study anaerobic bacterial infection. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 404 (2017).
- Macneil, S. Progress and opportunities for tissue-engineered skin. Nature. 445 (7130), 874-880 (2007).
- Theuretzbacher, U., Outterson, K., Engel, A., Karlén, A. The global preclinical antibacterial pipeline. Nature Reviews Microbiology. 18 (5), 275-285 (2019).
- Miethke, M., et al. Towards the sustainable discovery and development of new antibiotics. Nature Reviews Chemistry. 5 (10), 726-749 (2021).
- Guedes, G. M. M., et al. Ex situ model of biofilm-associated wounds: Providing a host-like environment for the study of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Applied Microbiology. 131 (3), 1487-1497 (2021).
- Johnson, C. J., et al. Augmenting the activity of chlorhexidine for decolonization of Candida auris from porcine skin. Journal of Fungi. 7 (10), 804 (2021).
- Horton, M. V., et al. Candida auris Forms High-Burden Biofilms in Skin Niche Conditions and on Porcine Skin. mSphere. 5 (1), 00910-00919 (2020).
- Ashrafi, M., et al. Validation of biofilm formation on human skin wound models and demonstration of clinically translatable bacteria-specific volatile signatures. Scientific Reports. 8, 1-16 (2018).
- Brackman, G., Coenye, T. In vitro and in vivo biofilm wound models and their application. Advances in Experimental Medicine and Biology. 897, 15-32 (2016).
- Rumbaugh, K. P., Carty, N. L. In Vivo Models of Biofilm Infection. Biofilm Infections. , 267-290 (2011).
- Boase, S., Valentine, R., Singhal, D., Tan, L. W., Wormald, P. J. A sheep model to investigate the role of fungal biofilms in sinusitis: Fungal and bacterial synergy. International Forum of Allergy & Rhinology. 1 (5), 340-347 (2011).
- Williams, D. L., et al. Experimental model of biofilm implant-related osteomyelitis to test combination biomaterials using biofilms as initial inocula. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 100 (7), 1888-1900 (2012).
- Scheerlinck, J. P. Y., Snibson, K. J., Bowles, V. M., Sutton, P. Biomedical applications of sheep models: From asthma to vaccines. Trends in Biotechnology. 26 (5), 259-266 (2008).
- Metcalfe, A. D., Ferguson, M. W. J. Tissue engineering of replacement skin: The crossroads of biomaterials, wound healing, embryonic development, stem cells and regeneration. Journal of the Royal Society Interface. 4 (14), 413-417 (2007).
- Kazemi-Darabadi, S., Sarrafzadeh-Rezaei, F., Farshid, A. A., Dalir-Naghadeh, B. Allogenous skin fibroblast transplantation enhances excisional wound healing following alloxan diabetes in sheep, a randomized controlled trial. International Journal of Surgery. 12 (8), 751-756 (2014).
- Martinello, T., et al. Allogeneic mesenchymal stem cells improve the wound healing process of sheep skin. BMC Veterinary Research. 14 (1), 1-9 (2018).
- Roberts, C. D., Windsor, P. A. Innovative pain management solutions in animals may provide improved wound pain reduction during debridement in humans: An opinion informed by veterinary literature. International Wound Journal. 16 (4), 968 (2019).
- Mazzone, L., et al. Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).
- Olkowska, E., Gržinić, G. Skin models for dermal exposure assessment of phthalates. Chemosphere. 295, 133909 (2022).
- Couto, N., et al. Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model. Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).
