Ett förfarande för leverans av en kemisk ablativ lösning till råttans bröstduktala träd för bildstyrd förebyggande behandling av bröstcancer beskrivs. Bröstepitelceller kan riktas mot minimal säkerhetsvävnadsskada genom kannulering direkt i nippelöppningen och intraduktal infusion av en 70% etanolbaserad ablativ lösning.
Det finns fortfarande ett begränsat antal primära insatser för att förebygga bröstcancer. För kvinnor med hög risk att utveckla bröstcancer är det mest effektiva ingreppet profylaktisk mastektomi. Detta är ett drastiskt kirurgiskt ingrepp där bröstepitelcellerna som kan ge upphov till bröstcancer avlägsnas helt tillsammans med den omgivande vävnaden. Målet med detta protokoll är att visa genomförbarheten av ett minimalt invasivt intraduktalt förfarande som kan bli ett nytt primärt ingrepp för förebyggande av bröstcancer. Detta lokala förfarande skulle företrädesvis ablatera bröstepitelceller innan de kan bli maligna. Intraduktala metoder för att leverera lösningar direkt till dessa epitelceller i gnagarmodeller av bröstcancer har utvecklats vid Michigan State University och på andra håll. Råttbröstkörteln består av ett enda duktalt träd som har en enklare och mer linjär arkitektur jämfört med det mänskliga bröstet. Kemiskt inducerade råttmodeller av bröstcancer erbjuder dock värdefulla verktyg för proof-of-concept-studier av nya förebyggande interventioner och skalbarhet från musmodeller till människor. Här beskrivs ett förfarande för intraduktal leverans av en etanolbaserad ablativ lösning innehållande tantaloxidnanopartiklar som röntgenkontrastmedel och etylcellulosa som gelningsmedel i råttmjölkens duktala träd. Tillförsel av vattenhaltiga reagenser (t.ex. cytotoxiska föreningar, siRNA, AdCre) genom intraduktal injektion har beskrivits tidigare i mus- och råttmodeller. Denna protokollbeskrivning betonar metodologiska förändringar och steg som unikt avser att leverera en ablativ lösning, formuleringsöverväganden för att minimera lokala och systemiska biverkningar av den ablativa lösningen och röntgenavbildning för in vivo-bedömning av duktal trädfyllning. Fluoroskopi och mikro-CT-tekniker gör det möjligt att bestämma framgången för ablativ lösningsleverans och omfattningen av duktal trädfyllning tack vare kompatibilitet med det tantalhaltiga kontrastmedlet.
För kvinnor i USA1 fortsätter bröstcancer (BC) att vara den mest diagnostiserade cancertypen och orsakar fler dödsfall än någon annan cancertyp utom lungcancer. Prognoser för 2022 uppskattar att 51 400 kvinnor kommer att diagnostiseras med karcinom in situ och 287 850 kvinnor kommer att diagnostiseras med invasivt karcinom och att 43 600 kvinnor kommer att dö av BC1. Trots prevalensen och dödligheten i samband med BC finns det få alternativ tillgängliga för primärprevention och translationell forskning om nya interventioner eftersom primärprevention inte prioriteras av federala myndigheter2. Profylaktisk mastektomi är det mest effektiva ingreppet för primärprevention. Detta förfarande rekommenderas dock endast för högriskindivider eftersom det är en större operation med livsförändrande konsekvenser3. Denna operation innebär fullständigt avlägsnande av bröstepitelcellerna från vilka cancerframkallande utvecklas såväl som den normala omgivande vävnaden. Individer avskräcks ofta från att använda denna procedur som sitt första alternativ för primärt ingripande på grund av de negativa effekterna av fysisk, psykisk och social stress. Av dessa skäl väljer även vissa högriskindivider att inte genomgå denna procedur och väljer istället vaksam väntan eller liknande övervakningsstrategier3. I tidigare publikation var leverans av 70% etanol (EtOH) direkt i det duktala trädet i musmodeller effektiv vid kemiskt ablating bröstepitelceller med begränsad skada på intilliggande normal vävnad och för att förhindra brösttumörbildning4. EtOH används i flera kliniska tillämpningar som antingen ett ablativ medel för lokal behandling av vissa cancerformer eller skleroserande medel för lokal behandling av arteriovenös svullnad och missbildningar 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Den låga toxiciteten och säkerhetsprofilen för EtOH är väl etablerad, eftersom i vissa procedurer upp till 50 ml 95% EtOH kan administreras per session 5,10.
Fullständigt avlägsnande av bröstepitelceller från vilka BC utvecklas är den mest avgörande komponenten i både profylaktisk mastektomi och lokal leverans av en ablativ lösning. Därför är bekräftelse av fullständig duktal trädfyllning nödvändig för att garantera att den ablativa lösningen har kommit i direkt kontakt med alla bröstepitelceller. Att leverera en lösning inom duktalträden och dess visualisering genom bildstyrd genomlysning eller duktografi är möjligt genom kliniska procedurer som redan finns15,16,17. Således kommer det att vara möjligt att enkelt genomföra och utvärdera denna procedur i kliniska prövningar. Ett viktigt steg för att fastställa effekten och translationell genomförbarhet av intraduktal (ID) ablation som en ny intervention för primärprevention kommer att vara att demonstrera genomförbarheten av denna röntgenvisualiseringsmetod i djurmodeller av ökande storlek och komplexitet i deras duktala trädarkitektur 4,18,19. Ett protokoll som skalar upp denna ablativa procedur från mus20 till råttmodeller beskrivs här. Medan mus- och råttduktala träd har en liknande linjär struktur och förgreningsmönster, är råttduktalträdet proportionellt större och omges av en mycket tätare stroma. Vi har implementerat en metod i laboratoriet för att framgångsrikt injicera varje bröstkörtel i en råtta under en serie veckosessioner med en ablativ lösning som innehåller ett kontrastmedel. Sessionsavstånd är nödvändigt för att säkerställa att djuren har minimala biverkningar av EtOH (figur 1 och figur 2). Förfarandet innefattar injektion av den ablativa lösningen direkt i nippelöppningen hos en isofluran-bedövad råtta med en 33 G nål. Några viktiga förbättringar av proceduren inkluderar användning av utökad antiinflammatorisk behandling, injektion av högre volymer per duktalt träd än vad som föreslås21 och gastäta sprutor för vätska och gaser. Behandlingstiden med 5 mg/kg karprofen (ett NSAID) från 48 timmar före till 1 vecka efter ID-injektioner är jämförbar med det antiinflammatoriska protokoll som används för skleroserande behandling av venös missbildning i kliniken. Behandlingen utförs på patienter under systemisk anestesi följt av 2 dagars antiinflammatoriska läkemedel såsom NSAID. Den antiinflammatoriska behandlingen kan förlängas med ytterligare några dagar för att minska lokal inflammation och eventuell smärta13. Som hos möss20 mildrar intraperitoneal injektion av en 5% sackaroslösning den kortsiktiga effekten av alkoholförgiftning hos råttor. Råttor kan injiceras med upp till 1 ml 70% EtOH (upp till 4 kanaler; 0,2 g / dL EtOH-innehåll i blod) i en enda session när de administreras med denna sackaroslösning; djur återhämtar sig helt inom 4 timmar efter ID-injektioner. Vi utför sekventiella sessioner för att ge tillräckligt med återhämtningstid när vi injicerar mer än 4 körtlar och / eller högre EtOH-koncentrationer. Alkoholförgiftning hos kvinnor kommer att vara mycket mindre sannolikt eftersom ID-injektion av alla duktala träd i båda brösten, förutsatt att 16 huvudkanaler16,17 och 2 ml per kanal22,23, med 70% EtOH skulle resultera i mindre än 0,1 g / dL EtOH-innehåll i blod och kan orsaka mild försämring.
Röntgenavbildning gör det möjligt att bestämma hur framgångsrik intraduktal leverans är i varje enskild körtel och om hela duktalträdet är fyllt (figur 1, figur 2, figur 3). Genomlysningsavbildning i realtid som förberedelse för mikro-CT-skanning och / eller 3D-rekonstruktion av DICOM-fildata kan användas för att bedöma omfattningen av lösningsleverans till det duktala trädet och eventuellt läckage i stroma. Användning av fluoroskopi kan bidra till att begränsa den totala strålningsdosen på djuret. Genomlysningstekniken approximerar närmare den avsedda kliniska applikationen för bildvägledning av denna ablativa behandling. Jämförelse av FDA-godkända jodinnehållande Isovue med tantaloxid (TaOx) nanopartiklar har utförts för att ytterligare förfina nyttan av den ablativa lösningen 4,19. Det har visat sig att TaOx är ett överlägset mikro-CT-kontrastmedel än Isovue för visualisering av den initiala fyllningen av det duktala trädet i möss 4,19. Här visar vi att TaOx är ett lämpligt kontrastmedel för att visualisera den initiala fyllningen av råttans duktala träd (figur 2 och figur 3). Både i translationell forskning och kliniska praxisapplikationer har gelningsmedlet etylcellulosa (EC) tillsatts till EtOH-lösningen för att minimera diffusion från de avsedda riktade regionerna 13,14,24,25,26,27,28,29. Studier har visat att tillägg av upp till 1,5% EC till EtOH-innehållande ablativa lösningar är kompatibelt med TaOx-baserad avbildning (figur 3). Dessa samt ytterligare förbättringar av den ablativa lösningen kan hjälpa till med färdig översättning av denna bildstyrda procedur till kliniken.
Som visas här ablaterar ID-leverans av 70% EtOH företrädesvis bröstepitelcellerna med begränsad säkerhetsskada på omgivande stroma och vaskulatur hos möss4. Lokal ablation av det duktala trädet är effektivt för att förhindra tumörbildning i musmodeller4. Här visar vi att detta ablativa förfarande kan skalas upp till råttor.
Detta är nästa steg på vägen till översättning av detta ablativa förfarande som ett alternativt ingrepp till profylaktisk mastektomi för primärt förebyggande av bröstcancer hos högriskindivider. Tillsats av TaOx nanopartiklar som ett röntgenkontrastmedel till den ablativa lösningen gör det möjligt att bedöma lösningens effektivitet vid förebyggande av tumörbildning, eftersom det kan bestämmas om proceduren lyckades eller inte vid fullständig fyllning av duktalträdet. Att använda fluoroskopi för att visualisera den injicerade bröstkörteln speglar vad som sannolikt kommer att göras i kliniken för att vägleda denna ID-procedur. Bildvägledning av hur mycket lösningen har fyllt det duktala trädet och när infusionen ska stoppas kommer att vara en viktig aspekt av den kliniska implementeringen för att säkerställa maximal fyllning av varje duktalträd. Felsökningar och användbara tips visas i tabell 1. Effektiviteten av detta ablativa förfarande kräver att den infunderade lösningen tar direktkontakt med alla epitelceller för att maximera celldödningshastigheten. Reservepitelceller i ett eller flera träd kan så småningom fungera som en källa för BC-utveckling. De andra grupperna rapporterade ID-tillförsel av viruspartiklar (t.ex. komponenter i Cre/LoxP- och/eller Cas9/CRISPR-system), hormoner och hormonantagonister (t.ex. prolaktin, fulvestrant), kemoterapeutiska medel (t.ex. cisplatin), siRNA och/eller antikroppar eller andra målsökande medel hos möss 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, råttor 21,33,46,47,48 och/eller kaniner 18,49,50,51,52,53 . Framgångsrik kannulering av upp till åtta duktala träd per bröst per bröst för lokal leverans av kemoterapi har rapporterats i oberoende kliniska studier 47,54,55. Bildvägledning för infusion av dessa andra lösningar som syftar till tumörförebyggande eller inriktade på lokal behandling skulle på samma sätt maximera deras effektivitet.
Skalbarheten och förfining av denna procedur från mus till råtta duktalt träd demonstreras här. TaOx nanopartikel i murin 4,19 och råtta (opublicerade data) duktalt träd ger högupplöst avbildning som överträffar de FDA-godkända jodinnehållande röntgenkontrastmedlen. På samma sätt är vi inte medvetna om andra duktala trädavbildningsmetoder hos möss40,41 eller andra djurmodeller18 som kan ge jämförbar upplösning med TaOx. Relevant för klinisk översättning är det faktum att gelningseffekten av EC i denna mellanstora råttmodeller är en möjliggörande formuleringsförfining för att minimera vävnadsskador i säkerhet. När vi fortsätter att bedöma detta ablativa ID-förfarande för dess förmåga att förhindra BC, kommer vi att kunna bestämma, mer exakt, från vilka körtlar BC utvecklas genom den tillagda informationen som tillhandahålls genom avbildning efter ID-leverans i kemiskt inducerade och andra råttmodeller av BC. Dessa data kommer att avgöra säkerheten för denna procedur och fastställa eventuella problem eller brister i huruvida partiella eller misslyckade behandlade duktala träd kan vara mer benägna att utveckla BC hos en högriskkvinna.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute R21 CA226579 och R01 CA258314 bidrag till LFS och av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 bidrag till EMS. Vi är tacksamma mot MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-anläggningen för användning av deras bildsystem och tekniska expertis. Vi tackar Dr. Danielle Ferguson för att ha granskat innehållet i videon och siffrorna för efterlevnad av riktlinjer för djurs välbefinnande.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |