JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Миллисекундная водородно-дейтериевая масс-спектрометрия для изучения структурной динамики альфа-синуклеина в физиологических условиях

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64050
,
1Living Systems Institute, Department of Biosciences,University of Exeter

Summary

Структурный ансамбль мономерного альфа-синуклеина влияет на его физиологическую функцию и физико-химические свойства. Настоящий протокол описывает, как выполнить миллисекундную масс-спектрометрию водорода/дейтерия-обмена и последующий анализ данных для определения конформационной информации о мономере этого внутренне неупорядоченного белка в физиологических условиях.

Abstract

Альфа-синуклеин (aSyn) является внутренне неупорядоченным белком, фибриллярные агрегаты которого в изобилии присутствуют в тельцах Леви и нейритах, которые являются отличительными признаками болезни Паркинсона. Тем не менее, большая часть его биологической активности, а также его агрегация, централизованно включает растворимую мономерную форму белка. Выяснение молекулярных механизмов биологии и патофизиологии aSyn требует структурно высокоразрешенных методов и чувствительно к биологическим условиям. Его изначально развернутые, метастабильные структуры делают мономерный aSyn трудноразрешимым для многих методов структурной биологии. Здесь описано применение одного из таких подходов: водородно-дейтерий-обменной масс-спектрометрии (HDX-MS) на миллисекундной шкале времени для изучения белков с низкой термодинамической стабильностью и слабыми факторами защиты, такими как aSyn. В миллисекундной шкале времени данные HDX-MS содержат информацию о доступности растворителя и водородно-связанной структуре aSyn, которые теряются при более длительном времени маркировки, в конечном итоге давая структурное разрешение до уровня аминокислот. Таким образом, HDX-MS может предоставлять информацию с высоким структурным и временным разрешением о конформационной динамике и термодинамике, внутри- и межмолекулярных взаимодействиях, а также структурном влиянии мутаций или изменений на условия окружающей среды. Несмотря на широкое применение, показано, как получать, анализировать и интерпретировать миллисекундные измерения HDX-MS в мономерном aSyn.

Introduction

Болезнь Паркинсона (БП) является нейродегенеративным заболеванием, поражающим миллионы людей во всем мире1. Он характеризуется образованием цитоплазматических включений, известных как тельца Леви и нейриты Леви в области черной субстанции мозга. Было обнаружено, что эти цитоплазматические включения содержат агрегаты внутренне неупорядоченного белка aSyn2. При БП и других синуклеинопатиях aSyn превращается из растворимого неупорядоченного состояния в нерастворимое, высокоструктурированное болезненное состояние. В своей родной форме мономерный aSyn принимает широкий спектр конформаций, стабилизированных дальнодействующими электростатическими взаимодействиями между его N- и C-концами и гидрофобными взаимодействиями между его C-концом и областью неамилоидного бета-компонента (NAC) 3,4,5,6. Любые нарушения в этих стабилизирующих взаимодействиях, такие как мутации, посттрансляционные модификации и изменения в локальной среде, могут привести к неправильному сворачиванию мономера, тем самым запуская процесс агрегации7.

В то время как существует огромное количество исследований олигомерной и фибриллярной форм aSyn 8,9,10,11, существует острая необходимость изучить мономерную форму белка и лучше понять, какие конформеры функциональны (и как), а какие склонны к агрегированию 8,9,10,11 . Будучи внутренне неупорядоченным, всего 14 кДа в размере и трудно кристаллизующимся, мономер aSyn не поддается большинству структурных биологических методов. Однако одним из методов, способных измерить конформационную динамику мономерного aSyn, является миллисекундный HDX-MS, который недавно породил важные структурные наблюдения, которые было бы сложно или невозможно получить в противном случае 12,13,14. Миллисекундный HDX-MS чувствительно измеряет среднее значение конформационного ансамбля белка путем мониторинга изотопного обмена на амидных водородах, что указывает на доступность растворителей и участие в сети водородных связей определенной области белка на миллисекундной шкале времени. Необходимо подчеркнуть миллисекундный аспект HDX-MS, поскольку из-за его изначально развернутой, метастабильной природы aSyn демонстрирует очень быструю кинетику водородообмена, которая проявляется значительно ниже нижнего предела обычных систем HDX-MS. Например, большая часть молекулы aSyn полностью обменяла водород на дейтерий во внутриклеточных условиях менее чем за 1 с. В настоящее время несколько лабораторий создали приборы для быстрого смешивания; В этом случае используется прототип быстромиссирующего гасящего прибора, способного выполнять HDX-MS с мертвым временем 50 мс и временным разрешением 1 мс15. В то время как миллисекундный HDX-MS в последнее время имеет острое значение в изучении aSyn, он представляет собой ценность для изучения внутренне неупорядоченных белков / областей более широко и большого количества белков с петлями / областями, которые только слабо стабильны. Например, пептидные препараты (например, инсулин; GLP-1/глюкагон; tirzepatide) и белки пептидного слияния (например, ингибитор ВИЧ FN3-L35-T1144) являются основными форматами лекарств, где информация о структуре и стабильности фазы раствора может быть критическим фактором для принятия решений о разработке лекарств, и, тем не менее, пептидный фрагмент часто только слабо стабилен и трудноизлечим HDX-MS в секундной шкалевремени 16,17,18,19,20 . Было показано, что эмерджентные методы HDX-MS с маркировкой в секундах/минутах доменов получают структурную информацию для G-квадруплексов ДНК, но должно быть возможно распространить ее на более разнообразные олигонуклеотидные структуры путем применения миллисекунд hdX-MS21.

Эксперименты HDX-MS могут быть выполнены на трех различных уровнях: (1) снизу вверх (при этом меченый белок переваривается протеолитически), (2) средний-нижний (при этом меченый белок переваривается протеолитически, а полученные пептиды фрагментируются далее методами мягкой фрагментации) и (3) сверху вниз (при этом методы мягкой фрагментации непосредственно фрагментируют меченый белок)22 . Таким образом, субмолекулярные данные HDX-MS позволяют локализовать обменное поведение в определенных областях белка, что делает критически важным наличие адекватного охвата последовательностей для таких экспериментов. Структурное разрешение любого эксперимента HDX-MS зависит от количества протеолитических пептидов или фрагментов, полученных из белка при переваривании или мягкой фрагментации, соответственно. В каждом из трех типов экспериментов, описанных выше, изменение амидного обмена на каждом пептиде / фрагменте отображается обратно на первичную структуру белка, чтобы указать на поведение локализованных областей белка. В то время как самое высокое структурное разрешение достигается за счет мягкой фрагментации, описание этих экспериментов выходит за рамки текущего исследования, которое фокусируется на измерении конформаций мономеров aSyn. Отличные результаты могут быть получены с помощью широко применяемого рабочего процесса «снизу вверх», описанного здесь.

Здесь представлены процедуры по следующим вопросам: (1) как подготовить и обработать образцы aSyn и буферы HDX-MS, (2) как выполнить отображение пептидов для эксперимента HDX-MS снизу вверх, (3) как получить данные HDX-MS о мономерном aSyn в физиологических условиях, особенно в миллисекундной временной области (с использованием специально разработанного инструмента; также были описаны альтернативные инструменты для миллисекундной маркировки), и (4) как обрабатывать и анализировать данные HDX-MS. Здесь приведены примеры методов, использующих мономерный aSyn при физиологическом рН (7,40) в двух условиях раствора. Хотя эти процедуры критически полезны при изучении aSyn, они могут быть применены к любому белку и не ограничиваются внутренне неупорядоченными белками.

Protocol

1. Экспрессия белка и очистка aSyn Подготовьте aSyn в соответствии с ранее опубликованным отчетом9. Диализуйте в безопасный буфер хранения (например, Tris, pH 7,2). При необходимости концентрируйте образец (например, микроцентрифужные трубки со спиновым фил?…

Representative Results

Из-за его внутренне неупорядоченной природы трудно уловить сложные структурные изменения в aSyn при физиологическом рН. HDX-MS контролирует изотопный обмен на магистральных амидных водородах, исследуя конформационную динамику и взаимодействия белков. Это один из немногих методов получен…

Discussion

В настоящей статье описаны следующие процедуры: (1) проведение экспериментов по пептидному картированию на мономерном aSyn для получения наивысшего охвата последовательностей, (2) получение миллисекундных данных HDX-MS на мономерном aSyn в физиологических условиях и (3) выполнение анализа дан…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NS финансируется Бриллиантовой юбилейной стипендией Совета университета. JJP поддерживается стипендией UKRI Future Leaders Fellowship [Номер гранта: MR/T02223X/1].

Materials

1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Tags

Alpha-synucleinHydrogen/deuterium ExchangeMass SpectrometryIntrinsically Disordered ProteinsPeptide MappingSample PreparationAutosamplerHDX RoboticsQuench BufferPeptide Coverage MapFast HDX Prototype InstrumentHDX Data Analysis Software
check_url/64050?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image