JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Millisekund väte / deuteriumutbyte masspektrometri för studier av alfa-synuklein strukturell dynamik under fysiologiska förhållanden

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64050
,
1Living Systems Institute, Department of Biosciences,University of Exeter

Summary

Det strukturella ensemblet av monomer alfa-synuklein påverkar dess fysiologiska funktion och fysikalisk-kemiska egenskaper. Detta protokoll beskriver hur man utför millisekundväte / deuteriumutbytesmasspektrometri och efterföljande dataanalyser för att bestämma konformationsinformationen om monomeren av detta inneboende oordnade protein under fysiologiska förhållanden.

Abstract

Alfa-synuklein (aSyn) är ett inneboende oordnat protein vars fibrillära aggregat är rikliga i Lewy-kroppar och neuriter, som är kännetecknen för Parkinsons sjukdom. Ändå involverar mycket av dess biologiska aktivitet, liksom dess aggregering, centralt den lösliga monomerformen av proteinet. Belysning av de molekylära mekanismerna i aSynbiologi och patofysiologi kräver strukturellt högt upplösta metoder och är känslig för biologiska förhållanden. Dess naturligt utfällda, metastabila strukturer gör monomer aSyn svårhanterlig för många strukturbiologiska tekniker. Här beskrivs tillämpningen av ett sådant tillvägagångssätt: väte/ deuteriumutbytesmasspektrometri (HDX-MS) på millisekundens tidsskala för studier av proteiner med låg termodynamisk stabilitet och svaga skyddsfaktorer, såsom aSyn. Vid millisekundens tidsskala innehåller HDX-MS-data information om lösningsmedelstillgänglighet och vätebunden struktur hos aSyn, som går förlorad vid längre märkningstider, vilket i slutändan ger strukturell upplösning upp till aminosyranivån. Därför kan HDX-MS ge information vid höga strukturella och tidsmässiga upplösningar om konformationsdynamik och termodynamik, intra- och intermolekylära interaktioner och de strukturella effekterna av mutationer eller förändringar i miljöförhållandena. Även om det är allmänt tillämpligt visas det hur man förvärvar, analyserar och tolkar millisekunder HDX-MS-mätningar i monomer aSyn.

Introduction

Parkinsons sjukdom (PD) är en neurodegenerativ sjukdom som drabbar miljontals människor världen över1. Det kännetecknas av bildandet av cytoplasmatiska inklusioner som kallas Lewy-kroppar och Lewy-neuriter i hjärnans substantia nigra pars compacta-region. Dessa cytoplasmatiska inklusioner har visat sig innehålla aggregat av det inneboende oordnade proteinet aSyn2. Vid PD och andra synucleinopatier omvandlas aSyn från ett lösligt oordnat tillstånd till ett olösligt, mycket strukturerat sjukt tillstånd. I sin ursprungliga form antar monomer aSyn ett brett spektrum av konformationer stabiliserade av långväga elektrostatiska interaktioner mellan dess N- och C-termini och hydrofoba interaktioner mellan dess C-terminus och icke-amyloid beta-komponent (NAC) region 3,4,5,6. Eventuella störningar i dessa stabiliserande interaktioner, såsom mutationer, post-translationella modifieringar och förändringar i den lokala miljön, kan leda till felveckning av monomeren, vilket utlöser aggregeringsprocessen7.

Medan det finns en stor mängd forskning om oligomera och fibrillära former av aSyn 8,9,10,11, finns det ett avgörande behov av att studera proteinets monomera form och bättre förstå vilka konformatorer som är funktionella (och hur) och vilka som är benägna att aggregera 8,9,10,11 . Att vara inneboende oordnad, endast 14 kDa i storlek och svår att kristallisera, är aSyn-monomeren inte mottaglig för de flesta strukturella biologiska tekniker. En teknik som kan mäta konformationsdynamiken hos monomer aSyn är dock millisekund HDX-MS, som nyligen har genererat viktiga strukturella observationer som annars skulle vara utmanande eller omöjliga att få 12,13,14. Millisekund HDX-MS mäter känsligt medelvärdet av proteinkonformationsensemblen genom att övervaka isotoputbytet vid amidväteer, vilket indikerar lösningsmedelstillgänglighet och vätebindningsnätverksdeltagande för en viss proteinregion på millisekundtidsskalan. Det är nödvändigt att betona millisekundaspekten av HDX-MS eftersom aSyn på grund av sin naturligt utvecklade, metastabila natur uppvisar mycket snabb väteutbyteskinetik som manifesterar sig långt under den nedre gränsen för konventionella HDX-MS-system. Till exempel har det mesta av aSyn-molekylen helt bytt ut väte mot deuterium under intracellulära förhållanden på mindre än 1 s. Flera laboratorier har nu byggt snabbblandande instrument; i detta fall används ett prototyp snabbt mixande släckflödesinstrument som kan utföra HDX-MS med en dödtid på 50 ms och en tidsupplösning på 1 ms15. Medan millisekund HDX-MS nyligen har varit akut viktigt i studien av aSyn, står det att vara värdefullt för att studera inneboende oordnade proteiner / regioner i större utsträckning och ett stort antal proteiner med loopar / regioner som bara är svagt stabila. Till exempel peptidläkemedel (t.ex. insulin; GLP-1/glukagon; tirzepatid) och peptidfusionsproteiner (t.ex. HIV-hämmaren FN3-L35-T1144) är viktiga läkemedelsformat där struktur- och stabilitetsinformation i lösningsfasen kan vara en kritisk ingång för beslut om läkemedelsutveckling, och ändå är peptiddelen ofta bara svagt stabil och svårhanterlig av HDX-MS vid sekundernas tidsskala 16,17,18,19,20 . Emergent HDX-MS-metoder med märkning i sekunder/minuter-domänerna har visat sig härleda strukturell information för DNA G-quadruplexer, men det bör vara möjligt att utvidga detta till mer olika oligonukleotidstrukturer genom tillämpning av millisekund HDX-MS21.

HDX-MS-experiment kan utföras på tre olika nivåer: (1) bottom-up (varigenom det märkta proteinet smälts proteolytiskt), (2) middle-down (där det märkta proteinet smälts proteolytiskt och de resulterande peptiderna fragmenteras ytterligare genom mjukfragmenteringstekniker), och (3) top-down (där mjukfragmenteringstekniker direkt fragmenterar det märkta proteinet)22 . Således tillåter submolekylära HDX-MS-data oss att lokalisera utbytesbeteendet till specifika regioner i ett protein, vilket gör det kritiskt att ha tillräcklig sekvenstäckning för sådana experiment. Den strukturella upplösningen för alla HDX-MS-experiment beror på antalet proteolytiska peptider eller fragment härledda från proteinet vid matsmältning respektive mjukfragmentering. I var och en av de tre experimenttyperna som beskrivs ovan mappas förändringen i amidutbyte vid varje peptid / fragment tillbaka på proteinets primära struktur för att indikera beteendet hos lokaliserade regioner i proteinet. Medan den högsta strukturella upplösningen uppnås genom mjuk fragmentering, är beskrivningen av dessa experiment utanför ramen för den aktuella studien, som fokuserar på mätning av aSyn-monomerkonformationer. Utmärkta resultat kan erhållas med det vanliga “bottom-up” -arbetsflödet som beskrivs här.

Här tillhandahålls procedurer för (1) hur man förbereder och hanterar aSyn-prover och HDX-MS-buffertar, (2) hur man utför peptidkartläggning för ett HDX-MS-experiment underifrån, (3) hur man förvärvar HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden, särskilt i millisekundtidsdomänen (med hjälp av ett specialbyggt instrument; alternativa instrument för millisekundmärkning har också beskrivits), och (4) hur man bearbetar och analyserar HDX-MS-data. Metoder som använder monomer aSyn vid fysiologiskt pH (7,40) i två lösningsförhållanden exemplifieras här. Även om de är kritiskt användbara i studien av aSyn, kan dessa procedurer tillämpas på vilket protein som helst och är inte begränsade till inneboende oordnade proteiner.

Protocol

1. Proteinuttryck och rening av aSyn Förbered aSyn efter en tidigare publicerad rapport9. Dialys till en säker lagringsbuffert (t.ex. Tris, pH 7,2 ). Koncentrera vid behov provet (t.ex. mikrocentrifugrör med spinnfilter med 3 kDa MWCO, 14 000 x g i cirka 10–30 minuter, se materialtabell).OBS: Det rekommenderas att inte koncentrera sig för mycket. Monomerensemblens integritet har inte verifierats längre än 25 μM.<…

Representative Results

På grund av dess inneboende oordnade natur är det svårt att fånga de invecklade strukturella förändringarna i aSyn vid fysiologiskt pH. HDX-MS övervakar isotoputbytet vid ryggradsamidväteer och undersöker proteinkonformationsdynamiken och interaktionerna. Det är en av få tekniker för att förvärva denna information vid höga strukturella och tidsmässiga upplösningar. Detta protokoll är i stort sett tillämpligt på ett brett spektrum av proteiner och buffertförhållanden, och detta exemplifieras genom m?…

Discussion

I den här artikeln beskrivs följande procedurer: (1) utföra peptidkartläggningsexperiment på monomer aSyn för att erhålla den högsta sekvenstäckningen, (2) förvärva millisekund HDX-MS-data på monomer aSyn under fysiologiska förhållanden och (3) utföra dataanalys och tolkning av de resulterande HDX-MS-data. De angivna procedurerna är i allmänhet enkla att utföra, varje märkningsexperiment varar vanligtvis bara cirka 8 timmar för tre replikat och åtta tidpunkter, och kartläggningsexperimentet varar ba…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

NS finansieras av Universitetsrådets Diamantjubileumsstipendium. JJP stöds av ett UKRI Future Leaders Fellowship [Bidragsnummer: MR/T02223X/1].

Materials

1 × 100 mm ACQUITY BEH 1.7 μm C18 column  Waters Corporation 186002346 Analytical column
Acetonitrile HPLC grade >99.9% HiPerSolv VWR 20060.420 For LC mobile phases
CaCl2 Sigma Aldrich C5670 Salt for HDX buffers
Chronos Axel Semrau (Purchased from Waters Corporation) 667006090 Scheduling software to enable multiple HDX-MS sample injections automatically. Alternative software is available from other vendors e.g. HDXDirector or LEAP Shell
Deuterium chloride Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-2-50 For HDX labelling buffers
Deuterium oxide (99.9% D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-4 Deuterated water
DynamX 3.0 Waters Corporation 176016027 Isotopic assignment and deuterium incorporation calculation
Enzymate BEH Pepsin Column Waters Corporation 186007233 Pepsin digestion column
Formic Acid, 99.0% LC/MS Grade Fisher Scientific 10596814 For LC mobile phases
Guanidinium hydrochloride Sigma Aldrich RDD001-500G Chaotrope/Denaturant
HDfleX University of Exeter N/A https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982
KCl Sigma Aldrich P3911 Salt for HDX buffers
LEAP HDX-2 CTC PAL sampling robot Waters Corporation 725000637 Autosampler robot
Leucine enkephalin Waters Corporation 186006013 For mass spectrometry lockspray calibration.
MassLynx Waters Corporation 667004007 Software controlling inlet methods and mass spectrometer
Maximum recovery vials Waters Corporation 600000670CV 100 pack including caps – used for quench tray in LEAP HDX-2
MgCl2 Sigma Aldrich M8266 Salt for HDX buffers
Millipore 0.22 µm syringe filters Millipore N9CA7069B Syringe filters
ms2min Applied Photophysics Ltd N/A fast-mix quench-flow millisecond hdx instrument
NaCl Sigma Aldrich S9888 Salt for HDX buffers
Peltier temperature controller LEAP Technologies Inc. HP115-COOL/D Peltier controller to set precise temperature of chambers in the LEAP robot.
ProteinLynx Global Server 3.0 Waters Corporation 715001030 Peptide identification software. Alternative software is available from other vendors.
Reagent pot caps Waters Corporation 186004632 100 pack
Reagent pots for LEAP HDX-2 Waters Corporation 186001420 100 pack excluding caps – used for buffers in LEAP HDX-2
Sodium deuteroxide (99.5% in D2O) Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories) DLM-57 For HDX labelling buffers
Spin filter microcentrifuge tubes (3 kDa MWCO) Amicon (Merck Sigma Aldrich) UFC5003 Micro centrifuge tubes to concentrate protein. This facilitates buffer exchange and accurate sample loading for HDX-MS experiments.
Synapt G2-Si mass spectrometer Waters Corporation 176850035 Mass spectrometer
Total recovery vials Waters Corporation 600000671CV 100 pack including caps – used for labelling tray in LEAP HDX-2
Tris-HCl Sigma Aldrich T3253-250G Buffer
Trizma base Sigma Aldrich T60040-B2005 Buffer
Urea Sigma Aldrich U5378-1KG Chaotrope/Denaturant
VanGuard 2.1 x 5 mm ACQUITY BEH C18 column  Waters Corporation 186004623 Trap desalting column
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson’s disease, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Breydo, L., Wu, J. W., Uversky, V. N. α-Synuclein misfolding and Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): Molecular Basis of Disease. 1822 (2), 261-285 (2012).
  3. Dedmon, M. M., Lindorff-Larsen, K., Christodoulou, J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. Mapping long-range interactions in α-synuclein using spin-label NMR and ensemble molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 127 (2), 476-477 (2005).
  4. Esteban-Martín, S., Silvestre-Ryan, J., Bertoncini, C. W., Salvatella, X. Identification of fibril-like tertiary contacts in soluble monomeric α-synuclein. Biophysical Journal. 105 (5), 1192-1198 (2013).
  5. McClendon, S., Rospigliosi, C. C., Eliezer, D. Charge neutralization and collapse of the C-terminal tail of alpha-synuclein at low pH. Protein Science. 18 (7), 1531-1540 (2009).
  6. Ranjan, P., Kumar, A. Perturbation in long-range contacts modulates the kinetics of amyloid formation in α-synuclein familial mutants. ACS Chemical Neuroscience. 8 (10), 2235-2246 (2017).
  7. Villar-Piqué, A., da Fonseca, T. L., Outeiro, T. F. Structure, function and toxicity of alpha-synuclein: the Bermuda triangle in synucleinopathies. Journal of Neurochemistry. 139, 240-255 (2015).
  8. Seetaloo, N., Zacharopoulou, M., Stephens, A. D., Schierle, G. S. K., Phillips, J. J. Local structural dynamics of alpha-synuclein correlate with aggregation in different physiological conditions. bioRxiv. , (2022).
  9. Stephens, A. D., et al. Extent of N-terminus exposure of monomeric alpha-synuclein determines its aggregation propensity. Nature Communications. 11 (1), 2820 (2020).
  10. Stephens, A. D., et al. Different structural conformers of monomeric α-synuclein identified after lyophilizing and freezing. Analytical Chemistry. 90 (11), 6975-6983 (2018).
  11. Lautenschläger, J., et al. C-terminal calcium binding of α-synuclein modulates synaptic vesicle interaction. Nature Communications. 9 (1), 712 (2018).
  12. Oganesyan, I., Lento, C., Tandon, A., Wilson, D. J. Conformational dynamics of α-synuclein during the interaction with phospholipid nanodiscs by millisecond hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (5), 1169-1179 (2021).
  13. Keppel, T. R., Weis, D. D. Analysis of disordered proteins using a simple apparatus for millisecond quench-flow H/D exchange. Analytical Chemistry. 85 (10), 5161-5168 (2013).
  14. Al-Naqshabandi, M. A., Weis, D. D. Quantifying protection in disordered proteins using millisecond hydrogen exchange-mass spectrometry and peptic reference peptides. Biochemistry. 56 (31), 4064-4072 (2017).
  15. Kish, M., et al. Allosteric regulation of glycogen phosphorylase solution phase structural dynamics at high spatial resolution. bioRxiv. , (2019).
  16. El-Amine, M., et al. Mechanisms of tolerance induction by a gene-transferred peptide-IgG fusion protein expressed in B lineage cells. Journal of Immunology. 165 (10), 5631-5636 (2000).
  17. Kishimoto, S., et al. Site-specific chemical conjugation of antibodies by using affinity peptide for the development of therapeutic antibody format. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 698-702 (2019).
  18. Xu, W., et al. A protein-based, long-acting HIV-1 fusion inhibitor with an improved pharmacokinetic profile. Pharmaceuticals. 15 (4), 424 (2022).
  19. Frías, J. P., et al. Tirzepatide versus semaglutide once weekly in patients with type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (6), 503-515 (2021).
  20. Gerstein, H. C., et al. Cardiovascular and renal outcomes with efpeglenatide in type 2 diabetes. The New England Journal of Medicine. 385 (10), 896-907 (2021).
  21. Largy, E., Gabelica, V. Native hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry of structured DNA oligonucleotides. Analytical Chemistry. 92 (6), 4402-4410 (2020).
  22. Marcsisin, S. R., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry: What is it and what can it tell us. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (3), 967-972 (2010).
  23. Glasoe, P. K., Long, F. A. Use of glass electrodes to measure acidities in deuterium oxide. Journal of Physical Chemistry. 64 (1), 188-190 (1960).
  24. Krȩzel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  25. Mayerhöfer, T. G., Pahlow, S., Popp, J. The Bouguer-Beer-Lambert law: Shining light on the obscure. ChemPhysChem. 21 (18), 2029-2046 (2020).
  26. Gasteiger, E., et al. . The Proteomics Protocols Handbook. , 571-607 (2005).
  27. Bateman, R. H., et al. A novel precursor ion discovery method on a hybrid quadrupole orthogonal acceleration time-of-flight (Q-TOF) mass spectrometer for studying protein phosphorylation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 13 (7), 792-803 (2002).
  28. Sørensen, L., Salbo, R. Optimized workflow for selecting peptides for HDX-MS data analyses. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (11), 2278-2281 (2018).
  29. Demmers, J. A. A., Rijkers, D. T. S., Haverkamp, J., Killian, J. A., Heck, A. J. R. Factors affecting gas-phase deuterium scrambling in peptide ions and their implications for protein structure determination. Journal of the American Chemical Society. 124 (37), 11191-11198 (2002).
  30. Seetaloo, N., Kish, M., Phillips, J. J. HDfleX: Software for flexible high structural resolution of hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry data. Analytical Chemistry. 94 (11), 4557-4564 (2022).
  31. Hageman, T. S., Weis, D. D. Reliable identification of significant differences in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements using a hybrid significance testing approach. Analytical Chemistry. 91 (13), 8008-8016 (2019).
  32. Hageman, T. S., Weis, D. D. A structural variant approach for establishing a detection limit in differential hydrogen exchange-mass spectrometry measurements. Analytical Chemistry. 91 (13), 8017-8024 (2019).
  33. Chetty, P. S., et al. Helical structure and stability in human apolipoprotein A-I by hydrogen exchange and mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (45), 19005-19010 (2009).
  34. Keppel, T. R., Weis, D. D. Mapping residual structure in intrinsically disordered proteins at residue resolution using millisecond hydrogen/deuterium exchange and residue averaging. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 547-554 (2015).
  35. Li, J., Rodnin, M. V., Ladokhin, A. S., Gross, M. L. Hydrogen-deuterium exchange and mass spectrometry reveal the pH-dependent conformational changes of diphtheria toxin T domain. Biochemistry. 53 (43), 6849-6856 (2014).
  36. Roder, H., Elöve, G. A., Englander, S. W. Structural characterization of folding intermediates in cytochrome c by H-exchange labelling and proton NMR. Nature. 335 (6192), 700-704 (1988).
  37. Rob, T., et al. Measuring dynamics in weakly structured regions of proteins using microfluidics-enabled subsecond H/D exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 84 (8), 3771-3779 (2012).
  38. Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition. Lab on a Chip. 13 (13), 2528-2532 (2013).
  39. Svejdal, R. R., Dickinson, E. R., Sticker, D., Kutter, J. P., Rand, K. D. Thiol-ene microfluidic chip for performing hydrogen/deuterium exchange of proteins at subsecond time scales. Analytical Chemistry. 91 (2), 1309-1317 (2018).
  40. Goswami, D., et al. Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).
  41. Coales, S. J., E, S. Y., Lee, J. E., Ma, A., Morrow, J. A., Hamuro, Y. Expansion of time window for mass spectrometric measurement of amide hydrogen/deuterium exchange reactions. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (24), 3585-3592 (2010).
  42. Hoyer, W., et al. Dependence of alpha-synuclein aggregate morphology on solution conditions. Journal of Molecular Biology. 322 (2), 383-393 (2002).
  43. Rand, K. D., Pringle, S. D., Morris, M., Engen, J. R., Brown, J. M. ETD in a traveling wave ion guide at tuned Z-spray ion source conditions allows for site-specific hydrogen/deuterium exchange measurements. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22 (10), 1784-1793 (2011).
  44. Kan, Z. Y., Ye, X., Skinner, J. J., Mayne, L., Englander, S. W. ExMS2: An integrated solution for hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry data analysis. Analytical Chemistry. 91 (11), 7474-7481 (2019).
  45. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Characterizing short-lived protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (20), 8591-8597 (2010).
  46. Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein. Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).
  47. Mistarz, U. H., et al. Photodissociation mass spectrometry accurately localizes sites of backbone deuteration in peptides. Analytical Chemistry. 90 (2), 1077-1080 (2017).
  48. Phillips, J. J., et al. Rate of asparagine deamidation in a monoclonal antibody correlating with hydrogen exchange rate at adjacent downstream residues. Analytical Chemistry. 89 (4), 2361-2368 (2017).

Tags

Alpha-synucleinHydrogen/deuterium ExchangeMass SpectrometryIntrinsically Disordered ProteinsPeptide MappingSample PreparationAutosamplerHDX RoboticsQuench BufferPeptide Coverage MapFast HDX Prototype InstrumentHDX Data Analysis Software
check_url/64050?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Seetaloo, N., Phillips, J. J. Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions. J. Vis. Exp. (184), e64050, doi:10.3791/64050 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image