Denne protokollen beskriver en analyse for å bestemme respons på levamisol, en farmakologisk agonist av en klasse Caenorhabditis elegans acetylkolinreseptorer. I denne flytende levamisolsvømmingsanalysen observerer og kvantitiserer forskere visuelt den tidsavhengige lammelsen av dyr dyrket i 24-brønnsplater.
Ved det nevromuskulære veikrysset (NMJ) fører bindingen av den eksitatoriske nevrotransmitteren acetylkolin (ACh) til postsynaptiske reseptorer til muskelkontraksjon. Som i vertebrat skjelettmuskulatur er kolinerg signalering i kroppsveggmusklene til modellorganismen Caenorhabditis elegans nødvendig for bevegelse. Eksponering for levamisol, en farmakologisk agonist av en klasse ACh-reseptorer på kroppens veggmuskler, forårsaker tidsavhengig lammelse av villdyr. Endret følsomhet for levamisol antyder defekter i signalering ved NMJ eller muskelfunksjon. Her presenteres en protokoll for en flytende levamisolanalyse utført på C. elegans dyrket i 24-brønnsplater. Kraftig svømming av dyrene i væske muliggjør vurdering og kvantifisering av levamisol-indusert lammelse i hundrevis av ormer over en times tidsperiode uten å kreve fysisk manipulasjon. Denne prosedyren kan brukes med både villtype og mutanter som har endret følsomhet for levamisol for å demonstrere de funksjonelle konsekvensene av endret signalering ved NMJ.
Aktivering av postsynaptiske acetylkolinreseptorer (AChRs) på skjelettmuskulatur resulterer i et elektrisk signal som fører til muskelkontraksjon. Forstyrrelse av nevromuskulær funksjon resulterer i myasteniske syndromer og muskeldystrofier hos mennesker 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans har blitt brukt mye for å lære om evolusjonært konserverte grunnleggende biologiske prosesser og sykdomsmekanismer. Vertebrate skjelettmuskler og C. elegans kroppsveggmuskler er funksjonelt ekvivalente i kontrollen av bevegelse5. Her presenteres en enkel analyse som kan brukes til å sammenligne villtype C. elegans med mutanter som har endret nevromuskulær signalering eller muskelfunksjon.
Eksitatoriske og hemmende innganger mottatt fra henholdsvis kolinerge og GABAergiske motorneuroner får muskler på den ene siden av C. elegans-kroppen til å trekke seg sammen mens musklene på den andre siden slapper av, noe som muliggjør koordinert bevegelse6. Levamisol, et anthelmintisk middel som brukes til å behandle parasittiske nematodeinfeksjoner, binder seg til og aktiverer konstitutivt en klasse AChRs på kroppens veggmuskler, noe som resulterer i tidsavhengig lammelse7. Dermed kan endret følsomhet for levamisol brukes til å identifisere C. elegans med defekter i balansen mellom eksitatorisk og hemmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. For eksempel mutasjoner i underenheter av levamisolfølsom AChR (L-AChR), som UNC-63, samt C. elegans homolog av Cubilin, LEV-10, som kreves for L-AChR-klynger ved synapsen, påvirker eksitatorisk signalering og resulterer i levamisolresistens 7,8. Mutasjoner i GABAA-reseptoren UNC-49 reduserer hemmende signalering og forårsaker overfølsomhet overfor levamisol12.
Overfølsomhet eller resistens mot levamisol har tradisjonelt blitt vurdert ved å overføre dyr til agarplater som inneholder levamisol og deretter regelmessig prodding ormene for å bestemme tidspunktet for lammelse oppstår13,14,15. Vi har utviklet en flytende levamisol svømmeanalyse som eliminerer behovet for fysisk manipulering av dyrene og muliggjør screening av hundrevis av dyr på bare 1 time. Her beskrives bruken av denne analysen med villtype, unc-63 (x26), lev-10 (x17) og unc-49 (e407) dyr. Imidlertid kan denne protokollen også utføres på C. elegans utsatt for RNAi, som ble gjort for å validere knockdowns identifisert i en genom-bred RNAi-skjerm for endret levamisolfølsomhet11.
For denne farmakologiske analysen ble ormer dyrket til voksen alder i 24-brønnsplater, 0,4 mM levamisol i M9-buffer ble tilsatt til hver brønn, og antall bevegelige dyr ble registrert hvert 5. minutt i 1 time. Levamisolindusert lammelse ble visuelt observert over tid, og etter fullført analyse ble data kvantifisert. Evalueringen av mutanter sammen med wild-type C. elegans tillater elevene å først gjøre spådommer om potensielle fenotypiske effekter og deretter utføre eksperimenter for å teste sine hypoteser. Avslutningsvis er denne enkle, billige, flytende levamisolanalysen en ideell måte å demonstrere virkningen av tap av spesifikke gener på NMJ-funksjonen.
Endret respons på levamisol kan identifisere gener som kreves for postsynaptisk kolinerg signalering og muskelfunksjon. Protokollen her beskriver en flytende levamisolanalyse som brukes til å kvantifisere tidsavhengig lammelse over en 1 time tidsperiode. Studentene gjør spådommer om effekten av visse genetiske mutasjoner, utfører et eksperiment med stor prøvestørrelse, og kvantitiserer deretter resultatene. Denne analysen er en enkel, effektiv måte å kvantifisere levamisol-indusert lammelse uten å plukke eller prodding dyr, noe som gjør den egnet for lavere laboratorier, samt forskere som studerer nevromuskulær overføring. Diskutert her er noen av de vanligste fallgruvene, begrensningene i analysen og en variasjon i protokollen som muliggjør bruk med RNAi knockdown dyr; Også diskutert her er hvordan denne analysen kan legges inn i en kursbasert grunnforskningserfaring.
Riktig forberedelse av 24-brønnsplatene er viktig. Først må bakterieplener være helt tørre før de oppdager L1-dyr i brønnene. Hvis ikke tørket nok, blandes bakteriene med levamisoloppløsningen under analysen, snu væsken overskyet og forhindrer individer i å kunne telle ormene. For det andre, når du synkroniserer ormer gjennom blekemiddelprep, må dyrene ikke bli utsatt for blekemiddelløsningen for lenge, da dette vil føre til at det beskyttende belegget på eggene går i oppløsning. For det tredje er det avgjørende å oppdage bare 20-30 L1s per brønn, da for mange ormer i brønnene gjør det ekstremt vanskelig å nøyaktig telle antallet som beveger seg i den tildelte tiden. Til slutt er det viktig å opprettholde en aseptisk teknikk under fremstillingen av platene, da forurensede brønner ikke kan analyseres.
Det er noen begrensninger som må vurderes når du utfører denne analysen. For det første kan telling av antall bevegelige ormer i hver brønn hvert 5. minutt være overveldende for personer som mangler tidligere laboratorieerfaring, og dette kan føre til upresis datainnsamling. Når det gjelder andre analyser som brukes til å bestemme legemiddelfølsomhet18,19, kan dette eksperimentet utføres med færre tidspunkter. For det andre er plating av sultne L1-er isolert fra en blekemiddelprep en enkel metode for å oppnå en synkronisert befolkning; Det må imidlertid gjøres justeringer dersom utviklingstidspunktet er forskjellig mellom stammene som analyseres. Det er mulig å plukke sent fjerde larvestadium dyr (L4s) i en 24-brønns plate for denne analysen; Men når du forbereder mange plater, er dette for arbeidskrevende. Alternativt bør man bestemme hvor lang tid det tar for hver stamme å nå L4 og deretter plassere L1-ene i brønnene på forskjellige tidspunkter for å justere for forskjeller i modningshastighet. Til slutt, mens denne analysen kan brukes til å identifisere nye gener som er viktige for postsynaptisk muskelfunksjon11, kan endret levamisolrespons også skyldes mutasjon eller RNAi-knockdown av presynaptiske gener12. Hvis endret levamisolfølsomhet observeres, må ytterligere eksperimenter utføres for å bestemme årsaken til denne fenotypen.
Ved å gjøre noen få modifikasjoner på 24-brønnsplatene, kan den beskrevne levamisolsvømmeanalysen også utføres på RNAi-knockdowndyr11. Gene knockdown gjennom RNAi kan oppnås ved å mate C. elegans bakterier som uttrykker dobbeltstrenget RNA som tilsvarer genet av interesse20. For fremstilling av RNAi-plater må 1 ml 1M IPTG og 1 ml 25 mg / ml karbenicillin tilsettes per liter medium etter fjerning fra autoklaven. Bakteriekulturer dyrkes ved å plukke en enkelt koloni i 3 ml LB-buljong pluss 3 μL 25 mg / ml karbenicillin, og riste ved 37 ° C over natten, og platekartet lages når de forskjellige bakteriene blir oppdaget i brønnene. C. elegans synkroniseres med blekemiddelprep som beskrevet; Imidlertid bør RNAi overfølsom eri-1 (mg366) stamme brukes i stedet for den ville typen for å øke gen knockdown. RNAi knockdowns resulterer i de samme levamisolfenotypene observert for tap av funksjon mutanter11.
Protokollen som presenteres her kan brukes i laboratorieforskning, som et frittstående eksperiment i bachelorlaboratoriet, eller i åpningsukene av et avansert grunnkurs som en introduksjon til grunnleggende C. elegans teknikker og nevromuskulær funksjon. I et mer avansert oppdagelsesbasert kurs kan studentene bruke denne analysen til å avgjøre om tapet av C. elegans homologer av gener mutert hos personer med myasteniske syndromer, muskeldystrofier eller myopatier endrer levamisolfølsomhet. Avslutningsvis gir denne enkle, billige levamisolfølsomhetsanalysen en praktisk tilnærming til å lære om signalering ved NMJ og få erfaring med å jobbe med C. elegans modellsystem.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Riya Dattani og Lauren Hogstrom, som samlet dataene i figur 2B, C blind for genotype i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (våren 2022) ved University of Delaware. Ytterligere informasjon om BISC413 kursbasert grunnforskningserfaring (CURE), samt tilgang til laboratoriehåndboken designet av J. Tanis, er tilgjengelig på forespørsel. Nematodestammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som støttes av NIH-ORIP (P40 OD010440). Dette arbeidet ble støttet av en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (til JET).
60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |