En stabilt etableret topunktsinjektion af lysophosphatidylcholin-induceret fokal demyeliniseringsmodel hos mus
Summary
Den nuværende protokol beskriver en topunktsinjektion af lysophosphatidylcholin via en stereotaksisk ramme for at generere en stabil og reproducerbar demyeliniseringsmodel hos mus.
Abstract
Receptormedieret lysophospholipid signalering bidrager til patofysiologien af forskellige neurologiske sygdomme, især multipel sklerose (MS). Lysophosphatidylcholin (LPC) er et endogent lysophospholipid forbundet med inflammation, og det kan fremkalde hurtig skade med toksicitet for myelinlipider, hvilket fører til fokal demyelinination. Her præsenteres en detaljeret protokol for stereotaktisk topunkts LPC-injektion, der direkte kan forårsage alvorlig demyelinering og replikere den eksperimentelle demyelineringsskade hurtigt og stabilt hos mus ved kirurgisk procedure. Denne model er således yderst relevant for demyelineringssygdomme, især MS, og den kan bidrage til den relaterede fremadskridende klinisk relevante forskning. Immunofluorescens og Luxol hurtige blå farvningsmetoder blev også brugt til at skildre tidsforløbet for demyelinisering i corpus callosum hos mus injiceret med LPC. Derudover blev adfærdsmetoden brugt til at evaluere musens kognitive funktion efter modellering. Samlet set er topunktsinjektionen af lysophosphatidylcholin via en stereotaxisk ramme en stabil og reproducerbar metode til at generere en demyelineringsmodel hos mus til yderligere undersøgelse.
Introduction
Receptormedieret lysophospholipid signalering involverer forskellige fysiologiske processer i næsten alle organsystemer1. I centralnervesystemet (CNS) spiller denne signalering en kritisk rolle i patogenerne af autoimmune neurologiske sygdomme såsom multipel sklerose (MS). Multipel sklerose er en kronisk immunmedieret lidelse karakteriseret ved patologisk demyelinering og inflammatorisk respons, der forårsager neurologisk dysfunktion og kognitiv svækkelse 2,3. Efter kontinuerlig tilbagefald og remittering under den tidlige sygdom udvikler de fleste patienter sig til sidst til det sekundære progressive stadium, hvilket kan forårsage irreversibel skade på hjernen og deraf følgende handicap4. Det antages, at det patologiske kendetegn ved det sekundære progressive kursus er demyeliniserende plaques forårsaget af inflammatoriske læsioner5. Eksisterende behandlinger for MS kan reducere risikoen for tilbagefald betydeligt. Der er dog stadig ingen effektiv terapi til langvarig demyeliniserende skade forårsaget af progressiv MS6. Således kræves en stabilt etableret og let reproducerbar model for at studere prækliniske terapier, der fokuserer på degeneration af hvidt stof.
Demyelinering og remyelinering er to store patologiske processer i udviklingen af multipel sklerose. Demyelinisering er tabet af myelinskede omkring axoner induceret af microglia med proinflammatoriske fænotyper7, og det fører til langsom ledning af nerveimpulser og resulterer i tab af neuroner og neurologiske lidelser. Remyelinering er et endogent reparationsrespons medieret af oligodendrocytter, hvor lidelser kan føre til neurodegeneration og kognitiv svækkelse8. Det inflammatoriske respons er afgørende for hele processen og påvirker både graden af myelinskader og reparation.
Derfor er en stabil dyremodel med vedvarende inflammatorisk demyelinering meningsfuld for yderligere udforskning af terapeutiske strategier for MS. På grund af kompleksiteten af MS er der etableret forskellige typer dyremodeller til at efterligne demyeliniserende læsioner in vivo, herunder eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE), toksisk-demyeliniserende modeller, cuprizon (CPZ) og lysophosphatidylcholin (LPC)9 . LPC er et endogent lysophospholipid forbundet med inflammation, og det kan fremkalde hurtig skade med toksicitet for myelinlipider, hvilket fører til fokal demyelinisering. Baseret på tidligere rapporter og forskning 10,11 leveres en detaljeret protokol med topunktsinjektion med nogle ændringer. Generelt producerer den klassiske etpunkts LPC-injektionsmodel kun lokal demyelinering på injektionsstedet og ledsages ofte af spontan remyelinering12,13. Imidlertid kan topunktsinjektions-LPC-modellen demonstrere, at LPC direkte kan inducere demyelinisering i musens corpus callosum og forårsage mere holdbar demyelinisering med lidt myelinregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
MS, en kronisk demyeliniserende sygdom i CNS, er en af de mest almindelige årsager til neurologisk dysfunktion hos unge voksne20. Klinisk oplever ca. 60%-80% af MS-patienter cyklussen af tilbagefald og remissioner, før de udvikler en sekundær progressiv MS21,22, og det fører i sidste ende til kumulative bevægelsesforstyrrelser og kognitive underskud over tid23. I øjeblikket dækker ingen enkelt eksperimentel m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Tilskud: 82071380, 81873743).
Materials
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis – a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
