Yüksek Çözünürlüklü Kardiyak Pozitron Emisyon Tomografisi/Küçük Hayvanlar için Bilgisayarlı Tomografi
Summary
Burada, küçük hayvanlar için yüksek çözünürlüklü pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi kullanılarak kardiyak fonksiyon ve morfolojinin nicelleştirilmesi için deneysel bir görüntüleme protokolü sunulmaktadır. Hem fareler hem de sıçanlar, iki tür için bilgisayarlı tomografi kontrast maddelerinin farklı gereksinimlerini tartışarak göz önünde bulundurulur.
Abstract
Pozitron emisyon tomografisi (PET) ve bilgisayarlı tomografi (BT) en çok kullanılan tanısal görüntüleme teknikleri arasındadır ve her ikisi de kardiyak fonksiyon ve metabolizmayı anlamada hizmet eder. Klinik öncesi araştırmalarda, farelerin ve sıçanların küçük kalp boyutu ve çok yüksek kalp atış hızlarının yarattığı zorlu teknolojik gereksinimlerle başa çıkmak için tasarlanmış, yüksek hassasiyete ve yüksek mekansal-zamansal çözünürlüğe sahip özel tarayıcılar kullanılmaktadır. Bu yazıda, hayvan hazırlığı ve görüntü edinimi ve rekonstrüksiyonundan görüntü işleme ve görselleştirmeye kadar kardiyak hastalıkların deneysel fare ve/veya sıçan modelleri için bimodal kardiyak PET/BT görüntüleme protokolü tanımlanmıştır.
Özellikle, 18 F etiketli florodeoksiglukoz ([18F] FDG)-PET taraması, sol ventrikülün (LV) farklı segmentlerinde glikoz metabolizmasının ölçülmesine ve görselleştirilmesine izin verir. Kutup haritaları bu bilgileri görüntülemek için kullanışlı araçlardır. BT kısmı, elektrokardiyografi (EKG) uçları olmadan retrospektif geçit kullanılarak tüm kalbin (4D-BT) zamana bağlı 3D rekonstrüksiyonundan oluşur, bu da LV’nin morfofonksiyonel değerlendirmesine ve ardından ejeksiyon fraksiyonu (EF) ve inme hacmi (SV) gibi en önemli kardiyak fonksiyon parametrelerinin nicelleştirilmesine izin verir. Entegre bir PET/BT tarayıcısı kullanılarak bu protokol, hayvanı farklı tarayıcılar arasında yeniden konumlandırmaya gerek kalmadan aynı anestezi indüksiyonu içinde yürütülebilir. Bu nedenle, PET/BT, kalp hastalıklarının birkaç küçük hayvan modelinde kalbin morfofonksiyonel ve metabolik değerlendirmesi için kapsamlı bir araç olarak görülebilir.
Introduction
Küçük hayvan modelleri, kardiyovasküler hastalıkların anlaşılmasının ilerlemesi için son derece önemlidir 1,2. İnvaziv olmayan, tanısal görüntüleme araçları, son yıllarda hem klinik hem de klinik öncesi ortamlarda kardiyak fonksiyona bakış açımızda devrim yarattı. Kalp hastalıklarının küçük hayvan modelleri söz konusu olduğunda, çok yüksek mekansal zamansal çözünürlükte spesifik görüntüleme araçları geliştirilmiştir. Bu nedenle, bu tür aletler, kalp yetmezliği (HF)3 veya miyokard enfarktüsü (MI)4 gibi spesifik hastalık modellerinde farelerin ve sıçanların çok küçük ve çok hızlı hareket eden kalpleri üzerindeki ilgili metabolik ve kinetik miyokard parametrelerinin doğru bir şekilde ölçülmesi ihtiyacını karşılayabilir. Bu amaçla, her biri kendi güçlü ve zayıf yönlerine sahip çeşitli yöntemler mevcuttur. Ultrason (US) görüntüleme, büyük esnekliği, çok yüksek zamansal çözünürlüğü ve nispeten düşük maliyeti nedeniyle en yaygın kullanılan yöntemdir. Küçük hayvanlarda ABD kardiyak görüntülemenin benimsenmesi,50 μm’nin altında uzamsal çözünürlüklere sahip ultra yüksek frekanslı 5,6 probları kullanan sistemlerin ortaya çıkmasından bu yana önemli ölçüde artmıştır.
Tam 3D kardiyak görüntüleme için ABD’nin ana dezavantajları arasında, tüm kalbin dinamik B modu görüntülerinin tam bir yığınını oluşturmak için probu motorlu bir çeviri aşamasına monte ederek kalp ekseni boyunca doğrusal taramalara ihtiyaç duyulması7. Sonunda, bu prosedür (her bir prob konumunda elde edilen görüntülerin doğru uzamsal ve zamansal kaydından sonra), düzlem içi ve düzlem dışı yönler arasında farklı uzamsal çözünürlüklere sahip bir 4B görüntüye yol açar. Aynı homojen olmayan uzamsal çözünürlük problemi, kalbin fonksiyonel görüntülemesinde hala altın standardı temsil eden kardiyak MR’da (CMR)8 ortaya çıkar. Bunun yerine hem bilgisayarlı tomografi (BT) hem de pozitron emisyon tomografisi (PET)9 kullanılarak gerçek izotropik 3D görüntüleme elde edilebilir. PET, BT, MR veya ABD’ye kıyasla daha düşük bir uzamsal çözünürlükten muzdarip olmasına rağmen, enjekte edilen prob miktarı başına (nanomolar aralıkta) görüntü sinyali açısından çok hassas bir araç sağlar. PET’in temel avantajı, organın patofizyolojisinin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları gösterebilmesidir. Örneğin, [18F] FDG enjeksiyonunu takiben bir PET taraması, vücuttaki glikoz metabolizmasının 3D haritasının yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bunu dinamik (yani, zaman çözümlü) veri toplama ile birleştirerek, izleyici kinetik modelleme, glikoz alımının metabolik hızlarının (MRGlu) parametrik haritalarını hesaplamak için kullanılabilir ve bu da miyokard canlılığı hakkında önemli bilgiler sağlayacaktır10.
BT, ilgili doku bileşenlerinin (örneğin, kana karşı kas) ölçülebilir bir şekilde geliştirilmesini sağlamak için yüksek konsantrasyonlarda (mL başına 400 mg’a kadar iyot) önemli miktarda harici kontrast madde (CA) gerektirir, ancak özellikle küçük hayvan görüntüleme için tasarlanmış son teknoloji ürünü mikro-BT tarayıcıları kullanıldığında, mekansal ve zamansal çözünürlükte üstündür. 11 Kardiyak PET/BT’nin uygulanabileceği tipik bir hastalık modeli, miyokard enfarktüsü ve kalp yetmezliğinin deneysel olarak değerlendirilmesi ve tedaviye yanıttır. Küçük hayvanlarda MI’yi indüklemenin yaygın bir yolu, sol ön inen (LAD) koroner arter 12,13’ün cerrahi olarak bağlanması ve daha sonraki günlerde hastalığın ilerlemesini ve kardiyak yeniden şekillenmenin uzunlamasına değerlendirilmesidir 4. Bununla birlikte, küçük hayvanlarda kalbin kantitatif morfofonksiyonel değerlendirmesi, yaşlanmanın kalp fonksiyonu üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi14 veya obezite modellerinde değiştirilmiş reseptör ekspresyonu15 gibi diğer hastalık modelleri için de büyük ölçüde uygulanabilir. Sunulan görüntüleme protokolü herhangi bir hastalık modeliyle sınırlı değildir ve bu nedenle, küçük kemirgenlerle yapılan klinik öncesi araştırmaların çeşitli bağlamlarında en geniş ilgi çekici olabilir.
Bu yazıda, küçük hayvan integrali PET/BT kullanılarak kardiyak görüntüleme için baştan sona deneysel bir protokol sunulmaktadır. Sunulan protokol belirli bir bimodal entegre tarayıcı için tasarlanmış olsa da, açıklanan prosedürün PET ve BT kısımları farklı üreticilerin ayrı tarayıcılarında bağımsız olarak gerçekleştirilebilir. Kullanılan PET/CT tarayıcıda, işlem sırası önceden programlanmış bir iş akışında düzenlenir. Her iş akışının ana dalları bir veya daha fazla edinme protokolüdür; Her bir satın alma protokolünün belirli ön işleme protokolleri için bir veya daha fazla dalı olabilir ve sırayla, her ön işleme protokolünün belirli yeniden yapılandırma protokolleri için bir veya daha fazla dalı olabilir. Hem hayvanın görüntüleme yatağında hazırlanması hem de görüntüleme işlemleri sırasında enjekte edilecek dış etkenlerin hazırlanması anlatılmaktadır. Görüntü yakalama prosedürünün tamamlanmasından sonra, yaygın olarak bulunan yazılım araçlarına dayanan nicel görüntü analizi için örnek prosedürler sağlanmıştır. Ana protokol fare modelleri için özel olarak tasarlanmıştır; fare bu alanda en çok kullanılan tür olmaya devam etse de, ana protokolün sonunda sıçan görüntüleme protokolünün bir uyarlamasını da gösteriyoruz. Hem fareler hem de sıçanlar için temsili sonuçlar gösterilir ve açıklanan prosedürlerle beklenebilecek çıktı türünü gösterir. Bu makalenin sonunda, tekniğin artılarını ve eksilerini, kritik noktaları ve farklı PET radyotracerlerinin hazırlık ve edinim / yeniden yapılanma adımlarında neredeyse hiçbir değişiklik yapmadan nasıl kullanılabileceğini vurgulamak için kapsamlı bir tartışma yapılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda sunulan protokol, yüksek çözünürlüklü PET/BT görüntüleme kullanılarak kardiyak hasarın küçük hayvan modelleri üzerinde translasyonel kardiyovasküler araştırmalar için tipik bir deneysel prosedüre odaklanmaktadır. Sunulan sonuçlar, PET ve Cine-CT görüntülerinin yüksek kantitatif ve kalitatif değerinin göstergesidir ve tüm kalbin glikoz metabolizması, şekli ve kasılma dinamikleri hakkında hem fonksiyonel hem de yapısal bilgi sağlar. Ayrıca, elde edilen tüm görüntüler 3D, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen JPI-HDHL-INTIMIC “GUTMOM” Projesi tarafından desteklenmiştir: Çocuklarda maternal obezite ve bilişsel işlev bozukluğu: GUT MicrobiOMe’nin neden-sonuç rolü ve erken diyet önleme (proje no. INTIMIC-085, İtalyan Eğitim, Üniversite ve Araştırma Bakanlığı Kararnamesi no. 946/2019).
Materials
| 0.9% sterile saline | Fresenius Kabi | 0.9% sodium chloride for injection | |
| 1025L Physiological Monitoring | Small Animal Instruments | Physiological monitoring system for small animal imaging | |
| 5 mL syringes | Artsana | Syringes with needle for injection of PET tracer | |
| Atomlab 500 | Else Nuclear | PET Dose calibrator | |
| Atrium software | Inviscan | Version 1.5.5 | PET/CT operating software |
| Butterfly catheters | Delta Med | 27.5 G needle | |
| Carimas software | Turku PET Center | Version 2.10 | Image analysis software |
| Fenestra VC | Medilumine | Lipid emulsion iodinated contrast agent for small animals | |
| Heat lamp | Heat lamp with clamp and switch | ||
| Insulin syringes | Artsana | Syringes with needle for injection of CT CA | |
| Iomeron 400 mgI/mL | Bracco | Iomeprol, vascular contrast agent | |
| IRIS PET/CT | Inviscan | PET/CT scanner for small animals | |
| Isoflurane | Zoetis | Inhalation anesthetic, 250 mL | |
| OneTouch Glucometer | Johnson&Johnson Medical | Glucose meter kit | |
| Osirix MD software | Pixmeo | Version 11 | Image analysis software |
| Oxygen | Air liquide | Compressed gas | |
| Rectal probe for 1025L | Small Animal Instruments | Rectal probe with cable for SAII 1025L systems | |
| Respiratory sensor for 1025L | Small Animal Instruments | Respiratory pillow with tubings for SAII 1025L systems | |
| TJ-3A syringe pump | Longer | Motorized syringe pump for CT CA injection |
References
- Zaragoza, C. Animal models of cardiovascular diseases. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 497841 (2011).
- Russell, J. C., Proctor, S. D. Small animal models of cardiovascular disease: Tools for the study of the roles of metabolic syndrome, dyslipidemia, and atherosclerosis. Cardiovascular Pathology. 15 (6), 318-330 (2006).
- Riehle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Menichetti, L., et al. MicroPET/CT imaging of αvß3 integrin via a novel 68Ga-NOTA-RGD peptidomimetic conjugate in rat myocardial infarction. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 40 (8), 1265-1274 (2013).
- Zhou, H., et al. Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 78 (1), 297-305 (2010).
- Di Lascio, N., Kusmic, C., Stea, F., Faita, F. Ultrasound-based pulse wave velocity evaluation in mice. Journal of Visualized Experiments. (120), e54362 (2017).
- Dann, M. M., et al. Quantification of murine myocardial infarct size using 2-D and 4-D high-frequency ultrasound. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 322 (3), 359-372 (2022).
- Espe, E. K. Novel insight into the detailed myocardial motion and deformation of the rodent heart using high-resolution phase contrast cardiovascular magnetic resonance. Journal of Cardiovascular Magnetic Resonance. 15 (1), 82 (2013).
- Vanhove, C., et al. Accurate molecular imaging of small animals taking into account animal models, handling, anaesthesia, quality control and imaging system performance. EJNMMI Physics. 2 (1), 31 (2015).
- Garcia, M. J., et al. State of the art: Imaging for myocardial viability: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Cardiovascular Imaging. 13 (7), 000053 (2020).
- Panetta, D., et al. Cardiac computed tomography perfusion: Contrast agents, challenges and emerging methodologies from preclinical research to the clinics. Academic Radiology. 28 (1), 1-18 (2020).
- Kusmic, C. Up-regulation of heme oxygenase-1 after infarct initiation reduces mortality, infarct size and left ventricular remodeling: experimental evidence and proof of concept. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 89 (2014).
- Muthuramu, I., Lox, M., Jacobs, F., De Geest, B. Permanent ligation of the left anterior descending coronary artery in mice: A model of post-myocardial infarction remodelling and heart failure. Journal of Visualized Experiments. (94), e52206 (2014).
- Fischer, M., et al. Comparison of metabolic and functional parameters using cardiac 18F-FDG-PET in early to mid-adulthood male and female mice. EJNMMI Research. 11 (1), 7 (2021).
- Valenta, I., et al. Feasibility evaluation of myocardial cannabinoid type 1 receptor imaging in obesity: A translational approach. JACC: Cardiovascular Imaging. 11 (2), 320-332 (2018).
- Fueger, B. J., et al. Impact of animal handling on the results of 18F-FDG PET studies in mice. Journal of Nuclear Medicine. 47 (6), 999-1006 (2006).
- . Carimas User Manual Available from: https://turkupetcentre.fl/carimas/files/archive/Html/a1.html (2022)
- Peters, A. M. Graphical analysis of dynamic data: The Patlak-Rutland plot. Nuclear Medicine Communications. 15 (9), 669-672 (1994).
- Choi, Y., et al. Parametric images of myocardial metabolic rate of glucose generated from dynamic cardiac PET and 2-[18F]fluoro-2-deoxy-d-glucose studies. Journal of Nuclear Medicine. 32 (4), 733-738 (1991).
- Laffon, E., Marthan, R. Is Patlak y-intercept a relevant metrics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 48 (5), 1287-1290 (2021).
- Flores, J. E., McFarland, L. M., Vanderbilt, A., Ogasawara, A. K., Williams, S. -. P. The effects of anesthetic agent and carrier gas on blood glucose and tissue uptake in mice undergoing dynamic FDG-PET imaging: Sevoflurane and isoflurane compared in air and in oxygen. Molecular Imaging and Biology. 10 (4), 192-200 (2008).
- Ng, C. K. Sensitivity of myocardial fluorodeoxyglucose lumped constant to glucose and insulin. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 260 (2), 593-603 (1991).
- Shoghi, K. I., Welch, M. J. Hybrid image and blood sampling input function for quantification of small animal dynamic PET data. Nuclear Medicine and Biology. 34 (8), 989-994 (2007).
- Heuberger, J., Pixmeo, S., Rosset, A. OsiriX User Manual. Blurb. , (2017).
- Cerqueira, M. D., et al. Standardized myocardial segmentation and nomenclature for tomographic imaging of the heart. A statement for healthcare professionals from the Cardiac Imaging Committee of the Council on Clinical Cardiology of the American Heart Association. Circulation. 105 (4), 539-542 (2002).
- Kolanowski, T. J., et al. Multiparametric evaluation of post-MI small animal models using metabolic ([18F]FDG) and perfusion-based (SYN1) heart viability tracers. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12591 (2021).
- Guiducci, L., et al. Contribution of organ blood flow, intrinsic tissue clearance and glycaemia to the regulation of glucose use in obese and type 2 diabetic rats: A PET study. Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases. 21 (9), 726-732 (2011).
- Tadinada, S. M., et al. Functional resilience of C57BL/6J mouse heart to dietary fat overload. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 321 (5), 850-864 (2021).
- Dreyfuss, A. D., et al. A novel mouse model of radiation-induced cardiac injury reveals biological and radiological biomarkers of cardiac dysfunction with potential clinical relevance. Clinical Cancer Research. 27 (8), 2266-2276 (2021).
- Hsu, B. PET tracers and techniques for measuring myocardial blood flow in patients with coronary artery disease. Journal of Biomedical Research. 27 (6), 452-459 (2013).
- Dinkel, J., et al. Intrinsic gating for small-animal computed tomography. Circulation: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 235-243 (2008).
- Kuntz, J., et al. Fully automated intrinsic respiratory and cardiac gating for small animal CT. Physics in Medicine and Biology. 55 (7), 2069-2085 (2010).
- Li, Y., Zhang, W., Wu, H., Liu, G. Advanced tracers in PET imaging of cardiovascular disease. BioMed Research International. 2014, 504532 (2014).
- Kim, D. -. Y., Cho, S. -. G., Bom, H. -. S. Emerging tracers for nuclear cardiac PET imaging. Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 52 (4), 266-278 (2018).
- Maddahi, J., Packard, R. R. S. Cardiac PET perfusion tracers: Current status and future directions. Seminars in Nuclear Medicine. 44 (5), 333-343 (2014).
- Bentourkia, M. Kinetic modeling of PET data without blood sampling. IEEE Transactions on Nuclear Science. 52 (3), 697-702 (2005).
- Lammertsma, A. A. Forward to the past: The case for quantitative PET imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (7), 1019-1024 (2017).
- Nahrendorf, M., et al. High-resolution imaging of murine myocardial infarction with delayed-enhancement cine micro-CT. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3172-3178 (2007).
- Badea, C. T., Fubara, B., Hedlund, L. W., Johnson, G. A. 4-D micro-CT of the mouse heart. Molecular Imaging. 4 (2), 110-116 (2005).
- Technical Resources. MediLumine Available from: https://www.medilumine.com/technical-resources (2019)
- Nebuloni, L., Kuhn, G. A., Müller, R. A Comparative analysis of water-soluble and blood-pool contrast agents for in vivo vascular imaging with micro-CT. Academic Radiology. 20 (10), 1247-1255 (2013).
- Panetta, D., et al. Performance evaluation of the CT component of the IRIS PET/CT preclinical tomograph. Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section A: Accelerators Spectrometers Detectors and Associated Equipment. 805, 135-144 (2016).
- Gu, J., et al. At what dose can total body and whole abdominal irradiation cause lethal intestinal injury among C57BL/6J mice. Dose-Response. 18 (3), 1559325820956783 (2020).
- Amirrashedi, M., Zaidi, H., Ay, M. R. Advances in preclinical PET instrumentation. PET Clinics. 15 (4), 403-426 (2020).
- Clark, D. P., Badea, C. T. Advances in micro-CT imaging of small animals. Physica Medica. 88, 175-192 (2021).
- Belcari, N., Del Guerra, A., Panetta, D., Grupen, C., Buvat, I. High-Resolution and Animal Imaging Instrumentation and Techniques. Handbook of Particle Detection and Imaging. , 1497-1535 (2021).
- Wang, G., Rahmim, A., Gunn, R. N. PET Parametric imaging: Past, present, and future. IEEE Transactions on Radiation and Plasma Medical Sciences. 4 (6), 663-675 (2020).
- Befera, N. T., Badea, C. T., Johnson, G. A. Comparison of 4D-microSPECT and microCT for murine cardiac function. Molecular Imaging and Biology. 16 (2), 235-245 (2014).
- van Deel, E., Ridwan, Y., van Vliet, J. N., Belenkov, S., Essers, J. In vivo quantitative assessment of myocardial structure, function, perfusion and viability using cardiac micro-computed tomography. Journal of Visualized Experiments. (108), e53603 (2016).
- Lee, C. -. L., et al. Assessing cardiac injury in mice with dual energy-microCT, 4D-microCT and microSPECT imaging following partial-heart irradiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 88 (3), 686-693 (2014).
- Harms, H., et al. Comparison of clinical non-commercial tools for automated quantification of myocardial blood flow using oxygen-15-labelled water PET/CT. European Heart Journal – Cardiovascular Imaging. 15 (4), 431-441 (2013).
- Nesterov, S. V., et al. Myocardial perfusion quantitation with 15O-labelled water PET: High reproducibility of the new cardiac analysis software (CarimasTM). European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 36 (10), 1594-1602 (2009).
- Nesterov, S. V., et al. Myocardial perfusion quantification with Rb-82 PET: Good interobserver agreement of Carimas software on global, regional, and segmental levels. Annals of Nuclear Medicine. 36, 507-514 (2022).
- Nesterov, S. V., et al. One-tissue compartment model for myocardial perfusion quantification with N-13 ammonia PET provides matching results: A cross-comparison between Carimas, FlowQuant, and PMOD. Journal of Nuclear Cardiology. , (2021).
- Thackeray, J. T., Kuntner-Hannes, C., Haemisch, Y. Preclinical Multimodality Imaging and Image Fusion in Cardiovascular Disease. Image Fusion in Preclinical Applications. , 161-181 (2019).
- Vohra, R., Batra, A., Forbes, S. C., Vandenborne, K., Walter, G. A. Magnetic resonance monitoring of disease progression in mdx mice on different genetic backgrounds. The American Journal of Pathology. 187 (9), 2060-2070 (2017).
- Baehr, A., et al. Agrin promotes coordinated therapeutic processes leading to improved cardiac repair in pigs. Circulation. 142 (9), 868-881 (2020).
- Lalwani, K., et al. Contrast agents for quantitative microCT of lung tumors in mice. Comparative Medicine. 63 (6), 482-490 (2013).
- Bertoldo, A., et al. Evaluation of compartmental and spectral analysis models of [18F]FDG kinetics for heart and brain studies with PET. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 45 (12), 1429-1448 (1998).
- Li, Y., Kundu, B. K. An improved optimization algorithm of the three-compartment model with spillover and partial volume corrections for dynamic FDG PET images of small animal hearts in vivo. Physics in Medicine and Biology. 63 (5), 055003 (2018).
- Mabrouk, R., Dubeau, F., Bentourkia, M., Bentabet, L. Extraction of time activity curves from gated FDG-PET images for small animals’ heart studies. Computerized Medical Imaging and Graphics. 36 (6), 484-491 (2012).
