Indkøb og perfusion-decellularisering af svin vaskulariserede klapper i en tilpasset perfusionsbioreaktor
Summary
Protokollen beskriver kirurgisk udtagning og efterfølgende decellularisering af vaskulariserede svineklapper ved perfusion af natriumdodecylsulfatvaskemiddel gennem klapvaskulaturen i en tilpasset perfusionsbioreaktor.
Abstract
Store volumen blødt vævsdefekter fører til funktionelle underskud og kan i høj grad påvirke patientens livskvalitet. Selvom kirurgisk rekonstruktion kan udføres ved hjælp af autolog fri klapoverførsel eller vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA), har sådanne metoder også ulemper. Spørgsmål som donorstedsmorbiditet og vævstilgængelighed begrænser autolog fri klapoverførsel, mens immunsuppression er en betydelig begrænsning af VCA. Konstruerede væv i rekonstruktiv kirurgi ved hjælp af decellularisering / recellulariseringsmetoder repræsenterer en mulig løsning. Decellulariseret væv genereres ved hjælp af metoder, der fjerner naturligt cellulært materiale, samtidig med at den underliggende ekstracellulære matrix (ECM) mikroarkitektur bevares. Disse acellulære stilladser kan derefter efterfølgende recellulariseres med modtagerspecifikke celler.
Denne protokol beskriver de indkøbs- og decellulariseringsmetoder, der anvendes til at opnå acellulære stilladser i en svinemodel. Derudover giver den også en beskrivelse af perfusionsbioreaktorens design og opsætning. Klapperne omfatter porcine omentum, tensor fascia lata og den radiale underarm. Decellularisering udføres via ex vivo perfusion af natriumdodecylsulfat (SDS) vaskemiddel med lav koncentration efterfulgt af DNase-enzymbehandling og pereddikesyresterilisering i en tilpasset perfusionsbioreaktor.
Vellykket vævsdecellularisering er kendetegnet ved et hvidt uigennemsigtigt udseende af klapper makroskopisk. Acellulære klapper viser fraværet af kerner ved histologisk farvning og en signifikant reduktion i DNA-indholdet. Denne protokol kan bruges effektivt til at generere decellulariserede bløddelsstilladser med bevaret ECM og vaskulær mikroarkitektur. Sådanne stilladser kan anvendes i efterfølgende recellulariseringsundersøgelser og har potentiale til klinisk oversættelse i rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skade og tumorfjernelse kan føre til store og komplekse bløddelsdefekter. Disse defekter kan forringe patientens livskvalitet, forårsage tab af funktion og resultere i permanent handicap. Mens teknikker som autolog vævsklapoverførsel er blevet almindeligt praktiseret, er problemer med klaptilgængelighed og donorstedsmorbiditet store begrænsninger 1,2,3. Vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA) er et lovende alternativ, der overfører sammensatte væv, fx muskler, hud, vaskulatur, som en enkelt enhed til modtagere. VCA kræver imidlertid langvarig immunsuppression, hvilket fører til lægemiddeltoksicitet, opportunistiske infektioner og maligniteter 4,5,6.
Vævskonstruerede acellulære stilladser er en potentiel løsning på disse begrænsninger7. Acellulære vævsstilladser kan opnås ved hjælp af decellulariseringsmetoder, som fjerner cellulært materiale fra indfødte væv, samtidig med at den underliggende ekstracellulære matrix (ECM) mikroarkitektur bevares. I modsætning til brugen af syntetiske materialer inden for vævsteknik tilbyder brugen af biologisk afledte stilladser et biomimetisk ECM-substrat, der muliggør biokompatibilitet og potentialet for klinisk oversættelse8. Efter decellularisering kan den efterfølgende recellularisering af stilladser med modtagerspecifikke celler derefter generere funktionelle, vaskulariserede væv med ringe eller ingen immunogenicitet 9,10,11. Ved at udvikle en effektiv protokol til opnåelse af acellulære væv ved hjælp af perfusionsdecellulariseringsteknikker kan en bred vifte af vævstyper konstrueres. Til gengæld giver bygningen på denne teknik applikationen mulighed for mere komplekse væv. Til dato er perfusionsdecellularisering af vaskulariseret blødt væv blevet undersøgt ved hjælp af enkle vaskulariserede væv såsom en fuld tykkelse fasciocutaneous flap i gnaver12, svin 13 og humane modeller14 samt porcine rectus abdominis skeletmuskel15. Derudover er komplekse vaskulariserede væv også blevet perfusion decellulariseret som demonstreret i svin og humant øre 16,17 modeller og human full-face graft modeller18.
Her beskriver protokollen decellulariseringen af vaskulariserede frie klapper ved hjælp af biologisk afledte ECM-stilladser. Vi præsenterer decellulariseringen af tre klinisk relevante klapper: 1) omentum, 2) tensor fascia lata og 3) den radiale underarm, som alle er repræsentative for arbejdshesteklapper, der rutinemæssigt anvendes i rekonstruktiv kirurgi og ikke tidligere er blevet undersøgt i dyreforsøg i forbindelse med vævsdecellularisering. Disse bioengineered klapper tilbyder en alsidig og let tilgængelig platform, der har potentiale til kliniske anvendelser til brug inden for reparation og rekonstruktion af store bløddelsdefekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den foreslåede protokol bruger perfusion af SDS med lav koncentration til at decellularisere en række svineafledte klapper. Med denne procedure kan acellulært omentum, tensor fascia lata og radiale underarmsklapper med succes decellulariseres ved hjælp af en protokol, der favoriserer SDS med lav koncentration. Foreløbige optimeringseksperimenter har fastslået, at SDS i en lav koncentration (0,05%) mellem 2 dage og 5 dage er i stand til at fjerne cellulært materiale til omentum, tensor fascia lata og radial underar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
