Upphandling och perfusion-decellularisering av vaskulära klaffar av svin i en anpassad perfusionsbioreaktor
Summary
Protokollet beskriver den kirurgiska tillvaratagandet och efterföljande decellularisering av vaskulariserade svinflikar genom perfusion av natriumdodecylsulfattvättmedel genom klaffvaskulaturen i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Abstract
Stora volymer mjukvävnadsdefekter leder till funktionella underskott och kan i hög grad påverka patientens livskvalitet. Även om kirurgisk rekonstruktion kan utföras med användning av autolog fri klafföverföring eller vaskulariserad kompositallotransplantation (VCA), har sådana metoder också nackdelar. Problem som sjuklighet på donatorstället och vävnadstillgänglighet begränsar autolog fri klafföverföring, medan immunsuppression är en betydande begränsning av VCA. Konstruerade vävnader i rekonstruktiv kirurgi med hjälp av decellulariserings- / recellulariseringsmetoder representerar en möjlig lösning. Decellulariserade vävnader genereras med hjälp av metoder som tar bort inbyggt cellulärt material samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. Dessa acellulära ställningar kan sedan recellulariseras med mottagarspecifika celler.
Detta protokoll beskriver de upphandlings- och decellulariseringsmetoder som används för att uppnå acellulära byggnadsställningar i en grismodell. Dessutom ger den också en beskrivning av perfusionsbioreaktorns design och installation. Flikarna inkluderar svinomentum, tensor fascia lata och den radiella underarmen. Decellularisering utförs via ex vivo-perfusion av natriumdodecylsulfat (SDS) tvättmedel med låg koncentration följt av DNas-enzymbehandling och perättiksyrasterilisering i en anpassad perfusionsbioreaktor.
Framgångsrik vävnadsdecellularisering kännetecknas av ett vitt ogenomskinligt utseende av flikar makroskopiskt. Acellulära flikar visar frånvaron av kärnor på histologisk färgning och en signifikant minskning av DNA-innehållet. Detta protokoll kan användas effektivt för att generera decellulariserade mjukvävnadsställningar med bevarad ECM och vaskulär mikroarkitektur. Sådana ställningar kan användas i efterföljande recellulariseringsstudier och har potential för klinisk översättning inom rekonstruktiv kirurgi.
Introduction
Traumatisk skada och tumöravlägsnande kan leda till stora och komplexa mjukvävnadsdefekter. Dessa defekter kan försämra patientens livskvalitet, orsaka förlust av funktion och resultera i permanent funktionshinder. Medan tekniker som autolog vävnadsklafföverföring har praktiserats ofta, är problem med klafftillgänglighet och sjuklighet på donatorstället stora begränsningar 1,2,3. Vaskulariserad sammansatt allotransplantation (VCA) är ett lovande alternativ som överför kompositvävnader, t.ex. muskler, hud, vaskulatur, som en enda enhet till mottagare. VCA kräver dock långvarig immunsuppression, vilket leder till läkemedelstoxicitet, opportunistiska infektioner och maligniteter 4,5,6.
Vävnadskonstruerade acellulära byggnadsställningar är en potentiell lösning på dessa begränsningar7. Acellulära vävnadsställningar kan erhållas med hjälp av decellulariseringsmetoder, som tar bort cellulärt material från inhemska vävnader samtidigt som den underliggande extracellulära matrisen (ECM) mikroarkitekturen bevaras. I motsats till användningen av syntetiska material inom vävnadsteknik erbjuder användningen av biologiskt härledda byggnadsställningar ett biomimetiskt ECM-substrat som möjliggör biokompatibilitet och potentialen för klinisk översättning8. Efter decellularisering kan den efterföljande recellulariseringen av byggnadsställningar med mottagarspecifika celler sedan generera funktionella, vaskulariserade vävnader med liten eller ingen immunogenicitet 9,10,11. Genom att utveckla ett effektivt protokoll för att erhålla acellulära vävnader med hjälp av perfusionsdecellulariseringstekniker kan ett brett spektrum av vävnadstyper konstrueras. I sin tur tillåter byggandet på denna teknik applikationen till mer komplexa vävnader. Hittills har perfusionsdecellularisering av vaskulariserade mjuka vävnader undersökts med hjälp av enkla vaskulariserade vävnader, såsom en fasciokutan flik med full tjocklek hos gnagare12, svin 13 och mänskliga modeller 14, samt svin rectus abdominis skelettmuskel15. Dessutom har komplexa vaskulariserade vävnader också perfusionsdecellulariserats, vilket visats i 16,17-modeller för svin och humant öraoch humana full-face-transplantatmodeller 18.
Här beskriver protokollet decellulariseringen av vaskulariserade fria klaffar med hjälp av biologiskt härledda ECM-ställningar. Vi presenterar decellulariseringen av tre kliniskt relevanta klaffar: 1) omentum, 2) tensor fascia lata och 3) radiell underarm, som alla är representativa för arbetshästflikar som används rutinmässigt vid rekonstruktiv kirurgi och inte tidigare har undersökts i djurstudier inom ramen för vävnadsdecellularisering. Dessa biotekniska klaffar erbjuder en mångsidig och lättillgänglig plattform som har potential för kliniska tillämpningar för användning inom reparation och rekonstruktion av stora mjukdelsdefekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det föreslagna protokollet använder perfusion av SDS med låg koncentration för att decellularisera en rad svin-härledda klaffar. Med denna procedur kan acellulär omentum, tensor fascia lata och radiella underarmsflikar framgångsrikt decellulariseras med hjälp av ett protokoll som gynnar SDS med låg koncentration. Preliminära optimeringsexperiment har fastställt att SDS vid en låg koncentration (0,05%) mellan 2 dagar och 5 dagar kan ta bort cellulärt material för omentum, tensor fascia lata och radiell under…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| 0.2 µm pore Acrodisk Filter | VWR | CA28143-310 | |
| 0.9 % Sodium Chloride Solution (Normal Saline) | Baxter | JF7123 | |
| 20 L Polypropylene Carboy | Cole-Parmer | RK-62507-20 | |
| 3-0 Sofsilk Nonabsorbable Surgical Tie | Covidien | LS639 | |
| 3-way Stopcock | Cole-Parmer | UZ-30600-04 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution, 100X | Wisent | 450-115-EL | |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| BD Angiocath 20-Gauge | VWR | BD381134 | |
| BD Angiocath 22-Gauge | VWR | BD381123 | |
| BD Angiocath 24-Gauge | VWR | BD381112 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | DNAse Co-factor |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| DNA assay (Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit) | Invitrogen | P7589 | |
| DPBS, 10X | Wisent | 311-415-CL | without Ca++/Mg++ |
| Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Heparin, 1000 I.U./mL | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Ismatec Pump Tygon 3-Stop Tubing | Cole-Parmer | RK-96450-40 | Internal Diameter: 1.85 mm |
| Ismatec REGLO 4-Channel Pump | Cole-Parmer | 78001-78 | |
| Ismatec Tubing Cassettes | Cole-Parmer | RK-78016-98 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| LB Agar Lennox | Bioshop Canada | LBL406.500 | Sterility testing agar plates |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | DNAse Co-factor |
| Masterflex L/S 16 Tubing | Cole-Parmer | RK-96410-16 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Monopolar Cautery Pencil | Valleylab | E2100 | |
| Normal Buffered Formalin, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| N°11 scalpel blade | Swann Morton | 303 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Peracetic Acid | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Plastic Barbed Connector for 1/4" to 1/8" Tube ID | McMaster-Carr | 5117K61 | |
| Plastic Barbed Tube 90° Elbow Connectors | McMaster-Carr | 5117K76 | |
| Plastic Quick-Turn Tube Plugs | McMaster-Carr | 51525K143 | Male Luer |
| Plastic Quick-Turn Tube Sockets | McMaster-Carr | 51525K293 | Female Luer |
| Punch Biopsy Tool | Integra Miltex | 3332 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Povidone-Iodine, 10% | Rougier | 833133 | |
| Serological Pipet, 2mL | Fisher Science | 13-678-27D | |
| Snap Lid Airtight Containers | SnapLock | 142-3941-4 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Powder | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| Surgical Metal Ligation Clips, Small | Teleflex | 001200 | |
| Stevens Tenotomy Scissors, 115 mm, straight | B. Braun | BC004R | |
| TruWave Pressure Monitoring Set | Edwards Lifesciences | PX260 |
References
- Richardson, D., Fisher, S. E., Vaughan, D. E., Brown, J. S. Radial Forearm Flap Donor-Site Complications and Morbidity: A Prospective Study. Plastic and Reconstructive Surgery. 99 (1), 109-115 (1997).
- Edsander-Nord, &. #. 1. 9. 7. ;., Jurell, G., Wickman, M. Donor-site morbidity after pedicled or free TRAM flap surgery: A prospective and objective study. Plastic and Reconstructive Surgery. 102 (5), 1508-1516 (1998).
- Qian, Y., et al. A systematic review and meta-analysis of free-style flaps: Risk analysis of complications. Plastic and Reconstructive Surgery. Global Open. 6 (2), 1651 (2018).
- Issa, F. Vascularized composite allograft-specific characteristics of immune responses. Transplant International. 29 (6), 672-681 (2016).
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Iske, J., et al. Composite tissue allotransplantation: Opportunities and challenges. Cellular and Molecular Immunology. 16 (4), 343-349 (2019).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016, 1541823 (2016).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Hussey, G. S., Dziki, J. L., Badylak, S. F. Extracellular matrix-based materials for regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 3, 159-173 (2018).
- Colazo, J. M., et al. Applied bioengineering in tissue reconstruction, replacement, and regeneration. Tissue Engineering. Part B Reviews. 25 (4), 259-290 (2019).
- Rouwkema, J., Rivron, N. C., van Blitterswijk, C. A. Vascularization in tissue engineering. Trends in Biotechnology. 26 (8), 434-441 (2008).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Jank, B. J., et al. Creation of a bioengineered skin flap scaffold with a perfusable vascular pedicle. Tissue Engineering – Part A. 23 (13-14), 696-707 (2017).
- Giatsidis, G., Guyette, J. P., Ott, H. C., Orgill, D. P. Development of a large-volume human-derived adipose acellular allogenic flap by perfusion decellularization. Wound Repair and Regeneration. 26 (2), 245-250 (2018).
- Zhang, J., et al. Perfusion-decellularized skeletal muscle as a three-dimensional scaffold with a vascular network template. Biomaterials. 89, 114-126 (2016).
- Duisit, J., et al. Decellularization of the porcine ear generates a biocompatible, nonimmunogenic extracellular matrix platform for face subunit bioengineering. Annals of Surgery. 267 (6), 1191-1201 (2018).
- Duisit, J., et al. Perfusion-decellularization of human ear grafts enables ECM-based scaffolds for auricular vascularized composite tissue engineering. Acta Biomaterialia. 73, 339-354 (2018).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Haughey, B. H., Panje, W. R. A porcine model for multiple musculocutaneous flaps. The Laryngoscope. 99 (2), 204-212 (1989).
- Khachatryan, A., et al. Radial Forearm Flap. Microsurgery Manual for Medical Students and Residents: A Step-by-Step Approach. , 177-181 (2021).
- Hammouda, B. Temperature effect on the nanostructure of SDS micelles in water. Journal of Research of the National Institute of Standards and Technology. 118, 151-167 (2013).
- Qu, J., Van Hogezand, R. M., Zhao, C., Kuo, B. J., Carlsen, B. T. Decellularization of a fasciocutaneous flap for use as a perfusable scaffold. Annals of Plastic Surgery. 75 (1), 112-116 (2015).
- Keane, T. J., Swinehart, I. T., Badylak, S. F. Methods of tissue decellularization used for preparation of biologic scaffolds and in vivo relevance. Methods. 84, 25-34 (2015).
- Mendibil, U., et al. Tissue-specific decellularization methods: Rationale and strategies to achieve regenerative compounds. International Journal of Molecular Sciences. 21 (15), 5447 (2020).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering. Part B Reviews. 28 (3), 677-693 (2022).
- Duisit, J., Maistriaux, L., Bertheuil, N., Lellouch, A. G. Engineering vascularized composite tissues by perfusion decellularization/recellularization: Review. Current Transplantation Reports. 8, 44-56 (2021).
- Adil, A., Xu, M., Haykal, S. Recellularization of bioengineered scaffolds for vascular composite allotransplantation. Frontiers in Surgery. 9, 843677 (2022).
- Phelps, E. A., García, A. J. Engineering more than a cell: Vascularization strategies in tissue engineering. Current Opinion in Biotechnology. 21 (5), 704-709 (2010).
- Pozzo, V., et al. A reliable porcine fascio-cutaneous flap model for vascularized composite allografts bioengineering studies. Journal of Visualized Experiments. (181), e63557 (2022).
- Uygun, B. E., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. Journal of Visualized Experiments. (48), e2394 (2011).
- Uzarski, J. S., et al. Epithelial cell repopulation and preparation of rodent extracellular matrix scaffolds for renal tissue development. Journal of Visualized Experiments. (102), e53271 (2015).
- Sullivan, D. C., et al. Decellularization methods of porcine kidneys for whole organ engineering using a high-throughput system. Biomaterials. 33 (31), 7756-7764 (2012).
- Choudhury, D., Yee, M., Sheng, Z. L. J., Amirul, A., Naing, M. W. Decellularization systems and devices: State-of-the-art. Acta Biomaterialia. 115, 51-59 (2020).
- Schilling, B. K., et al. Design and fabrication of an automatable, 3D printed perfusion device for tissue infusion and perfusion engineering. Tissue Engineering. Part A. 26 (5-6), 253-264 (2020).
