的 本文描述了一种胚胎拯救方案，用于再生来源于种间杂交的未成熟胚胎 Cucurbita pepo 和 Cucurbita moschata该方案易于重复，将为葫芦科作物育种项目提供重要的资源。
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本文内容
摘要
摘要
在葫芦属（Cucurbita）作物（南瓜）中进行种间杂交有助于扩大遗传变异并实现有益等位基因的渐渗。这些远缘杂交产生的未成熟胚胎必须通过适当的胚胎拯救技术进行再生。尽管该技术已在多种作物中建立，但目前尚缺乏针对南瓜、可用于常规应用的详细方法描述。本文介绍了一种适用于 C. pepo 与 C. moschata 种间杂交的胚胎拯救方案。为确定可用于胚胎拯救的有效杂交组合，共进行了24个种间杂交试验。其中22个杂交组合成功坐果，坐果率达92%。然而，所获得的果实大多为单性结实，种子中无胚胎（空籽）。仅有一个杂交组合产生了可在基础植物生长培养基上再生的未成熟胚胎。从该种间F1代果实中共成功拯救出10个胚胎，胚胎拯救成功率为80%。本研究建立的胚胎拯救方案将对南瓜育种项目中的种间杂交具有重要应用价值。
引言
南瓜属 (2n = 40) 是葫芦科中一个遗传多样性极为丰富的属，包含27个不同物种，其中5个为栽培种1其中 中国南瓜，美洲南瓜 和 C. maxima 是全球最具经济重要性的。在美国， C. moschata 和 C. pepo 是农业生产中最重要的两个物种。 C. pepo 包含四个亚种（ovifera, 瓠果, 异卵的，以及 gumala) 包含弯颈、直颈、栗子形、圆边、科科泽尔、蔬菜 marrow、西葫芦和南瓜等夏南瓜和冬南瓜栽培品种组2,3,4,5. C. moschata 主要包括冬季南瓜市场类型，如胡桃南瓜、迪金森南瓜和奶酪南瓜组1这两个物种在形态学和表型上具有多样性，且 C. pepo 因其产量高、早熟、丛生生长习性以及多样的果实性状（如果实形状、果实大小、果肉颜色和果皮花纹）而受到重视。另一方面， C. moschata 因其耐热、耐湿....
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方案
1. 种植与授粉
注意：确定能够通过杂交产生果实的相容基因型非常重要 以及可存活胚胎的产生。
- 种植条件与植株管理
- 获取用于杂交的南瓜基因型（品种/品系）种子（表1）。
- 使用添加了完全NPK肥料的育苗基质填充50孔育苗盘（25 cm宽 × 50 cm长），肥料含量为1.38 g/kg N、1.38 g/kg P和1.38 g/kg K。
- 将种子播种至与其种子长度相等的深度，并用育苗基质覆盖。浇水时避免积水，之后每天手动浇水一次，保持基质湿润。
- 在第二片真叶期，将幼苗移栽至直径25 cm至30 cm的花盆中，每盆加入3汤匙完全NPK肥料。每周施用一次液体肥料，每盆施500 mL，肥料NPK比例为20:20:20，配制浓度为每加仑水中加入1 g肥料。
- 将植株置于温室中培养，温度维持在22–28 °C，光照采用自然光条件。对于蔓生型基因型，需在温室内提供支撑用棚架（图1）。
- 授粉操作
- 通常情况下，南瓜开花始于播种后6至8周，具体时间因品种而异（图2A、B
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结果
果实坐果与种子活力
初步测试用于测定多种杂交组合下的坐果率和种子活力。共使用15种南瓜基因型和四种 C. pepo 和 11 C. moschata，被选中（表1）。在尝试的24种种间杂交组合中，有22种获得了果实结实（表2），代表总体 >坐果成功率为92%。O与M以及E与J杂交未获得成熟果实，而F与J杂交获得的果实数量最多（n = 6）。表2不同杂交组合的授粉花朵数量介于1至11朵之间，授粉成功率在0%至100%之间。不同杂交组合中授粉花朵的数量取决于花序数量以及雌雄花开花期的同步程度。尽管除两个组合外其余杂交均获得了果实，但切开果实进行评估后发现，大多数果实中的胚胎已发生败育，未能形成可存活的种子。多数杂交果实外观正常，但无种子或种子仅含有退化的胚胎。所有杂交组合共产生44个果实，其中仅有一个果实（由C与J杂交获得）含有发育不良的胚胎，可通过胚胎拯救技术进行挽救。
胚胎拯救及后续.......
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讨论
成功进行种间杂交的两个主要瓶颈是 C. moschata 和 C. pepo：由基因型决定的杂交亲和性障碍，即产生杂交胚胎的能力，以及受精后的发育障碍，即阻碍杂交胚胎发育为正常种子的过程。如先前在南瓜中所报道的，本研究中的杂交亲和性测试显示，大多数果实为单性结实，且多数种子无活力16亲本基因型对种间杂交的亲和性具有显著影响 C. moschata 和 C. pepo在本研究测试的24种杂交组合中，仅有一种组合（C与J）获得了可用于胚胎拯救的未成熟胚胎。因此，由于缺乏生物学重复，本研究在验证所开发方案效率方面受到限制。然而，从C与J杂交组合中拯救的10个未成熟胚胎中，获得了80%的再生效率。既往研究报道的胚胎拯救再生成功率较低 C. pepo 和 C. moschata 杂交，从而证明了新方案的有效性14,15例如，De Oliveira 等人报道，在26个来自杂交的胚.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由美国农业部 国家食品与农业研究所、NRS 项目编号 FLA-TRC-006176 以及佛罗里达大学食品与农业科学研究所资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氨苄青霉素 | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| 高压灭菌 | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| 天平 | |||
| 头孢噻肟 | Sigma-Aldrich | C 7039 | |
| 离心管（1.5 ml） | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| 去垢剂 | |||
| 乙醇，95% | Decon Labs | 2805HC | |
| 镊子 | VWR | 82027-408 | |
| 结冷胶 | Caisson Laboratories | G024 | |
| 生长室或光照培养架 | |||
| 层流罩 / 生物安全柜 | 贝克公司 | 埃奇加德 | |
| 美纹纸胶带 | Uline | S-11735 | |
| 培养基瓶 | |||
| 穆拉希吉 & 斯科格培养基 | 研究产品国际公司 | M10200 | |
| NPK 肥料 (20-20-20) | BWI 公司股份有限公司 | PR200 | |
| Osmocote Plus 肥料 | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| 培养皿（60 × 15 mm） | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| 花盆 | BWI 公司股份有限公司 | NP4000BXL | |
| 塑料食品容器，重复使用 | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| 塑料吊牌 | 亚马逊 | B07QTZRY6T | |
| 盆栽混合土 | 快乐园丁 | Pro-Line C/B | |
| 育苗盘 | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| 注射器滤器（0.22 μm） | ExtraGene | B25CA022-S | |
| 格架支撑 | 家得宝 | 2A060006 | |
| 水浴锅 |
参考文献
- Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T.
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重印与许可
