Denne protokollen er en veiledning for visualisering av dynamisk aktin og mikrotubuler ved hjelp av en in vitro total intern fluorescens (TIRF) mikroskopianalyse.
Tradisjonelt har aktin og mikrotubule cytoskeletoner blitt studert som separate enheter, begrenset til spesifikke cellulære regioner eller prosesser, og regulert av forskjellige suiter med bindende proteiner som er unike for hver polymer. Mange studier viser nå at dynamikken i begge cytoskeletale polymerer er sammenflettet og at denne krysstale er nødvendig for de fleste cellulære atferd. En rekke proteiner involvert i aktin-mikrotubule interaksjoner er allerede identifisert (dvs. Tau, MACF, GASS, formins og mer) og er godt preget med hensyn til enten aktin eller mikrotubuler alene. Imidlertid viste relativt få studier analyser av aktin-mikrotubul koordinering med dynamiske versjoner av begge polymerer. Dette kan okkludere fremvoksende koblingsmekanismer mellom aktin- og mikrotubuler. Her tillater en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopibasert in vitro rekonstitueringsteknikk visualisering av både aktin- og mikrotubuldynamikk fra den biokjemiske reaksjonen. Denne teknikken bevarer polymerisasjonsdynamikken til enten aktinfilament eller mikrotubuler individuelt eller i nærvær av den andre polymeren. Kommersielt tilgjengelig Tau protein brukes til å demonstrere hvordan aktin-mikrotubul atferd endres i nærvær av en klassisk cytoskeletal crosslinking protein. Denne metoden kan gi pålitelig funksjonell og mekanistisk innsikt i hvordan individuelle regulatoriske proteiner koordinerer aktinmikrotubuldynamikk ved en oppløsning av enkeltfilamenter eller komplekser med høyere rekkefølge.
Historisk sett har aktin- og mikrotubuler blitt sett på som separate enheter, hver med sitt eget sett med regulatoriske proteiner, dynamikkatferd og distinkte cellulære steder. Rikelig bevis viser nå at aktin- og mikrotubulpolymerer engasjerer seg i funksjonelle krysstalemekanismer som er avgjørende for å utføre mange celleprosesser, inkludert migrasjon, mitotisk spindelposisjonering, intracellulær transport og cellemorfologi 1,2,3,4. De forskjellige koordinerte atferdene som ligger til grunn for disse eksemplene, er avhengige av en intrikat balanse mellom koblingsfaktorer, signaler og fysiske egenskaper. Imidlertid er de molekylære detaljene som underbygger disse mekanismene fortsatt stort sett ukjente fordi de fleste studier fokuserer på en enkelt cytoskeletal polymer om gangen 1,2,5.
Aktin- og mikrotubuler samhandler ikke direkte 6,7,8. Den koordinerte dynamikken i aktin og mikrotubuler sett i celler formidles av flere faktorer. Mange proteiner som antas å regulere aktin-mikrotubul krysstale har blitt identifisert og deres aktiviteter er godt preget med hensyn til enten cytoskeletal polymer alene 1,2. Voksende bevis tyder på at denne enkeltpolymertilnærmingen har skjult de doble funksjonene til noen av proteinene / kompleksene som muliggjør aktinmikrotubulkoblingshendelser 7,8,9,10,11,12,13. Eksperimenter der begge polymerene er til stede er sjeldne og definerer ofte mekanismer med en enkelt dynamisk polymer og statisk stabilisert versjon av de andre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Dermed er det nødvendig med metoder for å undersøke de fremvoksende egenskapene til aktin-mikrotubule koordinerende proteiner som bare kan forstås fullt ut i eksperimentelle systemer som bruker begge dynamiske polymerer.
Kombinasjonen av direkte proteinmerkingsmetoder, genetisk kodede affinitetskoder og total intern refleksjonsfluorescens (TIRF) mikroskopi har blitt brukt med stor suksess i biomimetiske rekonstitueringssystemer 19,20,21,22,23. Mange nedenfra-og-opp-ordninger inneholder ikke alle faktorene som regulerer proteiner i celler. Imidlertid har “biokjemi på et coverglass” -teknologi raffinert mange mekanismer for aktin- og mikrotubuldynamikk ved høye romlige og tidsmessige skalaer, inkludert komponentene som kreves for polymermontering eller demontering, og motorproteinbevegelse 5,12,23,24,25,26,27 . Her beskrives en minimal komponentfilamenttilnærming for å undersøke aktinmikrotubulkobling in vitro. Denne protokollen kan brukes med kommersielt tilgjengelige eller svært rene rensede proteiner, fluorescerende merkede proteiner, perfusjonskamre og utvidet til mer kompliserte ordninger som inneholder celleekstrakter eller syntetiske systemer. Her brukes kommersielt tilgjengelig Tau-protein for å demonstrere hvordan cytoskeletal dynamikk endres i nærvær av et aktin-mikrotubule koblingsprotein, men kan erstattes med andre putative aktin-mikrotubule koordinerende faktorer. Den største fordelen med dette systemet over andre tilnærminger er evnen til samtidig å overvåke dynamikken i flere cytoskeletale polymerer i en reaksjon. Denne protokollen gir også brukerne eksempler og enkle verktøy for å kvantifisere endringer i cytoskeletale polymerer. Dermed vil protokollbrukere produsere pålitelige, kvantitative, enkeltfilamentoppløsningsdata for å beskrive mekanismer som ligger til grunn for hvordan forskjellige regulatoriske proteiner koordinerer aktin-mikrotubuledynamikk.
Bruken av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi til visualiserte rensede proteiner har vært en fruktbar og overbevisende tilnærming for å dissekere unike mekanismer for cytoskeletal regulering 5,23,24,25,26,27,35. Sammenlignet med tradisjonelle biokjemiske analyser krever TIRF-reaksjoner svært små volumer (50-100 μL), og kvantitative målinger av cytoskeletal dynamikk kan hentes fra en individuell analyse. De fleste studier av cytoskeletal dynamikk fokuserer på et enkelt polymersystem (dvs. aktinfilamenter eller mikrotubuler), og dermed har detaljerte målinger av krysstale eller fremvoksende atferd mellom aktinfilamenter og mikrotubuler som vanligvis ses i celler, forblitt unnvikende og vanskelig å rekapitulere i reagensrøret. For å løse dette problemet beskriver denne protokollen et enkeltfilament TIRF mikroskopisystem som muliggjør direkte visualisering av dynamisk aktin- og mikrotubulpolymerer i samme biokjemiske reaksjon. Dermed går denne metoden utover tradisjonelle analyser som rekapitulerer den dynamiske oppførselen til aktinfilamenter eller mikrotubuler alene. Denne teknikken ble også utført med Tau som et eksempel på hvordan flere dynamiske egenskaper endres i nærvær av en cytoskjelettkoblingsfaktor. Denne protokollen kan brukes med ekstra proteiner kjent eller mistenkt for å koordinere aktin- eller mikrotubuldynamikk, inkludert (men ikke begrenset til) MACF, GAS, formins og mer. Til slutt kan gitte eksempelanalyser brukes som en veiledning for å kvantifisere data som er samlet inn med denne protokollen.
“Seeing is believeing” er en overbevisende grunn til å utføre mikroskopibaserte analyser. Det kreves imidlertid forsiktighet ved utførelse og tolkning av TIRF mikroskopiforsøk. En stor utfordring med cytoskeletal co-assembly analyser er at mange ofte brukte bildeforhold ikke er kompatible hver polymer. Mikrotubuler og aktin har vanligvis forskjellige krav til buffer, temperatur, salt, nukleotid og konsentrasjon for polymerisering. Aktin, tubulin, regulatoriske proteiner av interesse, og bufferne som brukes i denne protokollen er følsomme for fryse-tine sykluser. Derfor er forsiktig håndtering av proteiner og buffere nødvendig for å kunne utføre denne protokollen. For å lindre mange av disse bekymringene anbefales det på det sterkeste å bruke nykokt tubulin (frosset i <6 uker) og forhåndsklarere frosne/resuspenderte aktiner via ultracentrifugation. Disse hensynene gjelder også for mylderet av regulatoriske proteiner som skal vurderes med denne prosedyren, som kan være følsomme for fryse-tine sykluser eller konsentrasjonen av buffersalter 5,11,36.
Dessverre finnes det ingen buffer som passer til alle størrelser uten eksperimentelle avveininger. For å passende mer volum for proteiner med lavere konsentrasjon, kan ATP og GTP inkluderes i 2x TIRF-bufferløsningen (figur 1C). Men fordi disse nukleotidene er ekstremt følsomme for fryse-tine sykluser, anbefales det ikke. Oksygenfangstforbindelsene som brukes her (dvs. katalase og glukoseoksidase) er nødvendige for å visualisere proteiner i lange perioder (minutter til timer), men er kjent for å begrense mikrotubul polymerisering ved høye konsentrasjoner5. Relatert til disse bufferhensynene er en begrensning i denne protokollen at noen kanoniske mikrotubule-assosierte regulatoriske proteiner kan kreve mer eller mindre salt for å rekapitulere funksjoner som finnes i celler eller analyser ved hjelp av mikrotubuler alene (uten aktin). Endring av saltets natur eller konsentrasjon for å løse disse bekymringene vil sannsynligvis påvirke frekvensen av aktinfilamentpolymerisering og / eller parametere for mikrotubuldynamikk. Målinger av flere beskrivende parametere (minimalt, kjernedannelse, forlengelseshastigheter og stabilitet) (figur 3) kreves for å bekrefte protokollsuksess eller eksplisitt dokumentere effekten av spesifikke buffere eller regulatoriske proteiner. For eksempel kan for mye aktinfilamentpolymerisering skjule aktin-mikrotubule koblingshendelser i løpet av sekunder. Følgelig vil finjustering av eksperimentelle forhold ved å senke den totale konsentrasjonen av aktin eller inkludert ekstra proteiner for å undertrykke aktinkjernedannelse (dvs. profilin) forlenge den totale perioden som koordinerte aktin-mikrotubule aktiviteter kan sees tydelig. Kontroller som adresserer disse forutsetningene, og tekniske replikeringer (utover flere synsfelt), er avgjørende for at brukerne skal kunne generere pålitelige og reproduserbare resultater.
Cellebaserte studier gir begrenset mulighet til å observere direkte proteinproteinrelasjoner eller virkningen av regulatoriske komplekser. I motsetning gjenspeiler noen av mekanismene som kommer fra in vitro-analyser ikke alltid den nøyaktige oppførselen til proteiner sett i celler. Dette klassiske biokjemiske dilemmaet kan løses i fremtidige anvendelser av denne teknikken med spesifikke modifikasjoner. For eksempel utvider tilsetning av funksjonelle fluorescerende merkede koblingsproteiner denne metoden fra enkeltfilamentstudier til enkeltmolekylstudier. Analyser kan endres ytterligere for å bruke celleekstrakter som kan legge til de “manglende” ukjente nøkkelfaktorene som kreves for å rekapitulere cellelignende fenomener. For eksempel har TIRF-baserte analyser som bruker gjær eller Xenopus-ekstrakter rekonstituert kontraktil actomyosin ringer37, mitatiske spindler26,38, komponenter av aktin- eller mikrotubulemontering39,40, og til og med dynamikk ved sentrosom- og kinetochores 36,41,42,43 . Videre kan slike systemer bane vei mot kunstige cellesystemer som har lipider eller signalfaktorer til stede 44,45,46.
The authors have nothing to disclose.
Jeg er takknemlig til Marc Ridilla (Repair Biotechnologies) og Brian Haarer (SUNY Upstate) for nyttige kommentarer til denne protokollen. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (GM133485).
1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
37 oC heatblock | |||
37 oC water bath | |||
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
70 oC incubator | |||
Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
Dry ice | |||
FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
Ice | |||
Ice bucket | |||
Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
Spectrophotometer | |||
Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |