Den nuværende protokol beskriver en metode til immunmærkning af et protein i hjertevævssektionerne ved hjælp af kvanteprikker. Denne teknik giver et nyttigt værktøj til at visualisere ethvert proteins subcellulære lokalisering og ekspression på ultrastrukturelt niveau.
Den subcellulære lokalisering er afgørende for at afgrænse korrekt funktion og bestemme de molekylære mekanismer for et bestemt protein. Flere kvalitative og kvantitative teknikker bruges til at bestemme den subcellulære lokalisering af proteiner. En af de nye teknikker til bestemmelse af den subcellulære lokalisering af et protein er kvanteprikker (QD) -medieret immunmærkning af et protein efterfulgt af billeddannelse af dem med transmissionselektronmikroskopi (TEM). QD er en halvleder nanokrystal med en dobbelt egenskab af krystallinsk struktur og høj elektrontæthed, hvilket gør dem anvendelige til elektronmikroskopi. Denne nuværende metode visualiserede den subcellulære lokalisering af Sigma 1-receptorprotein (Sigmar1) ved hjælp af QD-TEM i hjertevævet på ultrastrukturelt niveau. Små terninger af hjertevævssektionerne fra en vildtype mus blev fastgjort i 3% glutaraldehyd, efterfølgende osmiceret, farvet med uranylacetat, efterfulgt af sekventiel dehydrering med ethanol og acetone. Disse dehydrerede hjertevævssektioner blev indlejret i epoxyharpikser med lav viskositet, skåret i tynde sektioner med 500 nm tykkelse, sat på gitteret og efterfølgende udsat for antigendemaskering med 5% natriummetaperiodat efterfulgt af slukning af de resterende aldehyder med glycin. Vævene blev blokeret efterfulgt af sekventiel inkubation i primært antistof, biotinyleret sekundært antistof og streptavidinkonjugeret QD. Disse farvede sektioner blev tørret og afbildet ved høj forstørrelse ved hjælp af TEM. QD-TEM-teknikken tillod visualisering af Sigmar1-proteinets subcellulære lokalisering på det ultrastrukturelle niveau i hjertet. Disse teknikker kan bruges til at visualisere tilstedeværelsen af ethvert protein og subcellulær lokalisering i ethvert organsystem.
Den menneskelige krop er sammensat af mange proteiner, der er ansvarlige for mange kropsfunktioner. Funktionen af proteiner afhænger i vid udstrækning af deres lokalisering i organet og cellulære organeller. Flere teknikker, herunder subcellulær fraktionering, immunfluorescens og vaskemiddelmedieret proteinekstraktion, bruges almindeligvis til at bestemme proteinets subcellulære lokalisering 1,2. Mikroskopi ved hjælp af immunfluorescerende farvestof er den mest anvendte metode blandt disse teknikker. Imidlertid er de fluorescerende farvestoffer, der anvendes i denne teknik, mindre stabile og tilbøjelige til fotoblegning3. Andre teknikker involverede højopløsningsmikroskopi for at visualisere proteinet på et ultrastrukturelt niveau ved immunmærkning af proteiner med elektrontætte, tungmetaller (guld, ferritin) eller kvanteprikker nanokrystaller og efterfulgt af visualisering af dem ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM)4,5.
QD er en halvleder nanokrystal sammensat af halvledermetalforbindelser med kontrollerbare fotoluminescensegenskaber, der har stor betydning i biologiske systemer3. QD nanokrystaller er lavet i et kerneskalformat, hvor en nanokrystal er indkapslet i dannelsen af nanokrystaller for at sikre deres korrekte stabilitet og funktion. Almindeligt anvendte core-shell nanokrystaller kombination er CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS, og CdTe/CdS/ZnS (core/shell/shell)3. Blandt disse nanokrystalkombinationer undersøges CdSe/ZnS og CdSe/CdS mest energisk og anvendes hyppigt som sekundære antistofkonjugater 3,6. Disse QD-nanopartikler har også fluorescerende egenskaber med forskellige excitations- og emissionsspektre end traditionelle fluorophorer. QD anvender excitation af elektroner fra bulkvalensbåndet til at udvise højere fluorescenskvanteudbytter sammenlignet med traditionelle fluorophorer. Nanokrystalarrangementet af halvledermetaller gør QD-medieret mærkning mere stabil og modstandsdygtig over for fotoblegning6. Derudover tillader nanokrystalkernen i QD og dens krystallinske struktur QD i forskellige størrelser at have en bred vifte af absorptionsspektre og meget smalle emissionstoppe7. Desuden er disse QD-partikler store nok til at give høj elektrontæthed, hvilket gør dem nyttige i højopløsningsmikroskopiteknikker, herunder transmissionselektronmikroskopi 5,8,9. Disse QD-nanokrystaller er også kommercielt tilgængelige i flere størrelser med forskellige fluorescensemissionsspektre og former, hvilket gør dem til en god kandidat til mærkning med flere antistoffer10,11.
QD-teknologi tiltrak stor betydning i biologisk forskning på grund af flere funktionelle egenskaber, herunder anvendelse i levende cellebilleddannelse, undersøgelse af transportmekanismer i cellen, membrantransport af proteinets diffusionsbevægelse, funktionel heterogenitet af celler og mærkning af intracellulær organel 3,12,13,14,15,16 . QD er også nyttig i molekylær diagnostik til målretning og påvisning af kræftvæv, karakterisering af tumorens molekylære profil og immunstatus og visualisering af glaslegeme og epiretinale membraner 3,17,18. Derudover kan QD også bruges i medicinske terapier til behandling af tumormaligniteter via fotodynamisk terapi og oftalmiske anomalier ved at levere medicin til øjnene 3,17,18,19.
Ved hjælp af disse meget nyttige QD-nanokrystaller bestemte denne undersøgelse den subcellulære lokalisering af et protein ved navn Sigma 1-receptor (Sigmar1). Sigmar1 er et allestedsnærværende udtrykt multi-tasking molekylært chaperonprotein. Omfattende undersøgelser med fokus på Sigmar1’s subcellulære lokalisering i forskellige væv og organer rapporterede en celle- og vævstypespecifik subcellulær lokalisering, der fremkaldte molekylær funktion20. I forskellige celler (neuronale, fotoreceptor- og immunceller) og væv (lever og hjerne) ved hjælp af forskellige biokemiske tilgange rapporterede undersøgelser lokalisering af Sigmar1 på endoplasmatisk retikulum (ER), mitokondrie-associeret ER-membran (MAM), nuklear kuvert, plasmamembran, nukleoplasmatisk retikulum, kerne og mitokondrier. På trods af alle disse undersøgelser forblev den subcellulære lokalisering af Sigmar1 i hjertet ukendt20. Derfor blev den subcellulære lokalisering af Sigmar1 i hjertevæv bestemt ved anvendelse af den QD-medierede immunmærkning efterfulgt af TEM-billeddannelse.
I denne undersøgelse blev QD-medieret immunmærkning brugt til tydeligt at vise den subcellulære lokalisering af Sigmar1. Ved hjælp af QD blev Sigmar1’s lokalisering på mitokondriemembranen, især den indre mitokondriemembran, afbildet i hjertevæv. Derudover blev Sigmar1 også fundet at være placeret på sarkoplasmatisk / endoplasmatisk retikulum (S / ER) og lysosomer på ultrastrukturelt niveau, som vist i figur 2A-D.
Et kritisk trin i denne protokol er ætsnings- eller antigendemaskeringstrinnet ved anvendelse af stærkt koncentreret natriummetaperiodatopløsning til at afsløre antigenet efter glutaraldehydfiksering og osmication. Denne protokol anvendte en enkelt behandling med en høj koncentration (5%) natriummetaperiodat i 30 minutter ved stuetemperatur. Ekstra pleje er nødvendig i dette trin, da en længere varighed eller højere koncentration for natriummetaperiodatinkubation vil resultere i aggregering af strukturer, tab af membrandefinition for organellerne og forårsage perforeringer i sektionen, hvilket gør det svært at visualisere proteinet eller strukturen. Alternativt kan en lavere koncentration af (3%) metaperiodatopløsning i to trin i 30 minutter også anvendes i stedet for 5% metaperiodat. Undersøgelser har vist, at denne mulighed viser lignende resultater som med 5% metaperiodatopløsning til et-trins 30 minutters inkubation. Imidlertid giver en 3% metaperiodatopløsning til 30 minutters inkubation i to gange bedre kontrol over processen26,27,28. Oprindeligt anvendte denne protokol inkubation af sektionerne med 10% metaperiodatopløsning i 30 minutter. På grund af for mange perforeringer skabt i vævsafsnittet ved denne koncentration blev den endelige koncentration og inkubationsvarighed af metaperiodatopløsningen imidlertid nedtrappet og optimeret til 5% i 30 minutter.
Et andet trin krævede optimering af fikseringstiden med glutaraldehyd. Suboptimal fiksering af væv resulterer i utilstrækkelig QD-mærkning, mens overfiksering af væv resulterer i højere uspecifik mærkning. Derfor skal der nøje overvejes ved bestemmelse og titrering af et optimalt vævsfikseringsniveau for korrekt og specifik mærkning af proteiner. I denne metode ved anvendelse af hjertevæv blev fikseringstiden med glutaraldehyd titreret ved hjælp af 24 timer og 48 timer som tidspunkter. Baseret på farvningsbillederne af de sektioner, der var fastgjort til begge tidspunkter, blev det konstateret, at sektioner fastgjort til 24 timer viste bedre resultater. Til dato er QD nanokrystaller tilgængelige i flere størrelser, herunder 525, 565, 585, 605, 655 og 705 nm11,29. Hver af disse QD har sine egne emissionsspektre og udsender fluorescens ved forskellige bølgelængder. Derudover viser disse kommercielt tilgængelige QD’er i forskellige størrelser forskellige former; for eksempel er QD 525, 565 og 585 næsten sfæriske med forskellige størrelser, mens QD 605, 655 og 705 er uregelmæssige aflange formede. Af disse forskellige QD-nanokrystaller kan QD 525, 565 og 655 let skelnes fra hinanden11,29. Disse forskelle i emissionsspektre og former gør QD til en god kandidat til multi-mærkning af proteiner og visualisering ved fluorescens og elektronmikroskopi. I denne undersøgelse blev en kommercielt tilgængelig QD, QD 655, brugt til at mærke Sigmar1-proteinet for at skelne det fra enhver ikke-specifik baggrund i de farvede sektioner.
Et andet modstykke til QD til proteinmærkning i højopløsningsmikroskopi er immunguldpartiklen. Immunogoldpartiklerne bruges traditionelt til at mærke proteiner til højopløsningsmikroskopi. Disse guldpartikler er meget elektrontætte og let identificerbare sammenlignet med QD nanokrystaller. QD udviser dog bedre effektivitet med bedre penetration i væv, højere stabilitet og holdbarhed og bedre tilbageholdelse af ultrastrukturelle komponenter, hvilket gør dem til en bedre kandidat til proteinmærkning 4,5. QD har også en unik evne til at blive detekteret ved både lys- og elektronmikroskopi, hvilket øger dets værdi i forhold til immunguldmærkning10.
En begrænsning af denne QD-medierede immunmærkning er brugen af osmiumtetroxid under behandlingen. Osmiumtetroxid bruges til at øge elektrontætheden, ledningsevnen og kontrasten mellem ellers mindre elektrontætte og mindre kontrasterende biologiske membranstrukturer 5,30. Imidlertid ødelægger brugen af osmiumtetroxid øjeblikkeligt og irreversibelt prøvens egenskab for at skabe fluorescens, når den er mærket med QD6. Dette begrænser brugen af QD i fluorescensmikroskopi. En alternativ tilgang, der udelader brugen af osmiumtetroxid, vil være fordelagtig med hensyn til at bevare de fluorescerende egenskaber og dermed den dobbelte anvendelse af QD-medieret immunmærkning. Nogle af de nyere modeller af TEM har mulighed for at vedhæfte EDX-systemet (Energy Dispersive X-Ray Analysis), der muliggør identifikation af materialernes elementære sammensætning. En anden begrænsning af undersøgelsen er manglen på elementær kortlægning af en prøve og billedanalyse ved hjælp af EDX. Derfor bør fremtidige undersøgelser fokusere på EDX-analysen af QD-spektrene for at analysere elementsammensætningen.
QD-mærkning af proteiner har fået stor opmærksomhed i nyere tid. QD tilbyder flere anvendelser og fordele inden for både biologisk forskning og medicinsk terapi. QD, der desuden er pakket ind med polydentatligand, udviser øget stabilitet, der opretholder kvanteudbyttet. Yderligere øger indkapsling af QD med disse bio-gunstige midler også dets biotilgængelighed i væv, hvilket gør det til en god kandidat til potentiel anvendelse til påvisning af tumorer, levende cellebilleddannelse, lægemiddelafgivelse og vævsbilleddannelse 3,31,32.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 og R01HL152723; LSUHSC-S CCDS Finish Line Award, COVID-19 Research Award og LARC Research Award til MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Kardiovaskulær og AHA Postdoctoral Fellowship til CSA (20POST35210789); og LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship til RA.
200 Mesh copper grid | Ted Pella | G200HH | |
6-month-old male mice with FVB/N background | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | ||
Acetone 100% | Fisher Chemicals | A949 | |
Antibody diluent | Dako | S3022 | |
anti-Sigmar1 antibody | Cell Signaling | 61994S | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma Aldrich | B7389 | |
BSAc (10%) | Electron Microscopy Sciences | 25557 | |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C7902 | |
Cytoseal Xyl | Thermo fisher | 8312-4 | |
DER 732C36AA10:C33 | Electron Microscopy Sciences | 13010 | |
Dextrose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Diamond Knife | Diatome | Histo; Ultra 450 | |
DMAE | Electron Microscopy Sciences | 13300 | |
Electron microscope | JEOL | JEOL-1400 Flash | |
ERL 4221 | Electron Microscopy Sciences | 15004 | |
Ethanol 100% | Fisher Chemicals | A405P | |
Glutaraldehyde 3% | Electron Microscopy Sciences | 16538-15 | |
Glycine | Alfa Aesar | A13816 | |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA56 | |
Micromolds | Ted Pella | 10505 | |
Microtome | Leica Microsystem | EM UC7 | |
Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
NSA | Electron Microscopy Sciences | 19050 | |
Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19150 | |
Parafilm | Genesse Scientific | 16-101 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P5655 | |
Potassium Phosphate monobasic | Sigma Aldrich | 71640 | |
Qdot 655 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10121MP | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP334 | |
Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358 | |
Sodium metaperiodate | Sigma Aldrich | 71859 | |
Sodium Phosphate dibasic | Sigma Aldrich | P9541 | |
Surgical blade (size 10) | Aspen surgical | 371110 | |
TEM image software | AMT-V700 | AMT TEM imaging systems | |
TEM imaging camera | XR80 TEM series | AMT TEM imaging systems | |
Toluidine Blue O solution (0.5%) | Fisher Scientic | S25612 | |
Uranyl acetate | Polysciences | 21447 |