このプロトコルでは、iDISCO+を使用して無傷のマウス脳の磁気共鳴イメージング、クリアリング、および免疫標識を行う方法について説明し、その後、ライトシート顕微鏡を使用したイメージングの詳細な説明、およびNuMorphを使用したダウンストリーム分析について説明します。
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方法論記事
MRI、組織透明化、ライトシート顕微鏡を用いた無傷新生児マウス脳の全脳単一細胞イメージングと解析
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
組織透明化とそれに続くライトシート顕微鏡(LSFM)により、無傷の脳構造の細胞分解能イメージングが可能になり、遺伝的または環境的摂動によって引き起こされる構造変化の定量的分析が可能になります。全脳イメージングは、細胞のより正確な定量化と、物理的に切片化された組織の一般的に使用される顕微鏡では見逃される可能性のある領域特異的な違いの研究をもたらします。ライトシート顕微鏡を使用してクリアされた脳を画像化すると、共焦点顕微鏡と比較して取得速度が大幅に向上します。これらの画像は非常に大量の脳構造データを生成しますが、除去された組織の画像で特徴の定量化を実行するほとんどの計算ツールは、すべての核ではなく、まばらな細胞集団のカウントに限定されています。
ここでは、分析ツールのグループであるNuMorph(核ベースの形態測定)を示し、生後4日目(P4)マウスの脳のアノテーション領域内のすべての核および核マーカーを、ライトシート顕微鏡でクリアしてイメージングした後、定量化します。組織クリアの脱水ステップによって引き起こされる収縮前の脳容積を測定する磁気共鳴画像法(MRI)、免疫標識を含むiDISCO+法を使用した組織クリアリング、続いて市販のプラットフォームを使用してマウスの脳を細胞解像度で画像化するライトシート顕微鏡について説明します。次に、強度差の修正、画像タイルのステッチ、複数のチャネルの整列、核のカウント、公開されているアトラスへの登録による脳領域の注釈付けに使用されるNuMorphを使用したこの画像分析パイプラインを示します。
このアプローチは、公開されているプロトコルとソフトウェアを使用して設計され、必要な顕微鏡と計算リソースを持つすべての研究者がこれらの手法を実行できるようにしました。これらの組織クリアリング、イメージング、および計算ツールは、皮質内の細胞タイプの3次元(3D)組織の測定と定量化を可能にし、あらゆる野生型/ノックアウトマウス研究デザインに広く適用できるはずです。
概要
単一細胞分解能での全脳イメージングは、神経科学における重要な課題です。細胞解像度の脳画像は、脳回路の詳細な分析とシステムレベルのマッピングを可能にし、その回路が神経精神障害の遺伝的または環境的危険因子、発生中の胚の細胞挙動、および成人脳の神経回路によってどのように破壊されるかを可能にします1,2,3。再構築された3D脳の高解像度画像を可能にする複数の組織学的方法があります。しかしながら、これらの技術は、高価で特殊な装置を必要とし、免疫標識と互換性がない場合があり、そしていくつかの方法の2次元(2D)性質は、切片化中の組織損傷および剪断をもたらし得る4、5。
最近の進歩は、組織切片を必要としない脳全体を画像化するための代替アプローチを提供しました。それらは、脳を透明にするために組織クリアリングを使用することを含みます。ほとんどの組織透明化法では、光散乱の主要な光源である脂質を除去し、イメージング中に目的の屈折率(RI)をサンプル浸漬溶液のRIと一致させることによって、透明性が達成されます。その後、光は散乱されることなく材料間の境界を通過することができます
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プロトコル
すべてのマウスは、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の施設動物管理使用委員会(IACUC)に従って使用され、承認されました。
1.マウスの解剖と灌流
注:以下の解剖は、注射器を使用してP4およびP14マウスで実施されました。灌流液の量は動物の年齢によって異なります。
- 灌 流
注意: パラホルムアルデヒド(PFA)は危険な化学物質です。化学ヒュームフードですべての灌流ステップを実行します。- 手術前に、腹腔内注射(100 mg / kg) で ペントバルビタールを投与し、麻酔薬を有効にします。.
- 動物が麻酔の手術面に到達したら、つま先をつまむ反応法を使用して無反応を確認します。
- 胸郭の下に横方向の切開を行い、動物の胸腔を露出させます。
- 湾曲した外科用ハサミを使用して、動物の片側の鎖骨まで胸郭を注意深く切り、反対側に同じ切り込みを入れて、胸骨を持ち上げて心臓を露出させます。
- 下行大動脈を損傷することなく、心臓に接続されている組織を慎重にトリミングしてから、右心房を少し切開して血管系から血液が流出できるようにします。
- シリンジベースの方法を使用して、P14およびP4に対してそれぞれ10 mLおよび7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(P....
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結果
iDISCO+プロトコルでは、目で簡単にわかる有意な組織収縮が発生するため(図2B)、組織透明化の前にこのパイプラインにMRIステップを追加して、組織透明化によって誘発される収縮を定量化しました。ワークフローは、MR画像から非脳組織を除去することから始まります(図2C)。次に、剛体変換(3つの並進角度と3つの回転角度)を適用して、MR画像をライトシート画像に位置合わせします(図2D)。そうすることで、組織クリアリング手順によって誘発された60%の総体積損失が観察され(図2E)、これは目による体積変化の推定と一致しました(図2B)。この結果は、5%-10%10,32の収縮が報告された以前の報告とはかなり異なります。収縮の違いは、.......
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ディスカッション
組織透明化法は、脳の3D細胞組織を測定するための有用な技術である。文献に記載されている多数の組織透明化方法があり、それぞれに利点と制限があります6、7、8、9。組織クリア画像内の細胞タイプを分析するための計算ツールの選択肢は比較的限られています。他の利用可能なツールは、セグメンテーションがそれほど難しくないまばらな細胞集団に実装されているか10,35、または組織拡張を利用している16。この論文では、iDISCO+組織透明化によるイメージングのためのマウス脳の準備について説明し、LSFMによってキャプチャされたマウス皮質の構造内の核を処理および定量するための計算パイプラインであるNuMorphを示します。イメージング時間の.......
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開示事項
著者は開示する利益相反を持っていません。
謝辞
この作業は、NIH(R01MH121433、R01MH118349、およびR01MH120125からJLSおよびR01NS110791からGW)と財団の支援を受けました。サンプルイメージングを支援してくれた顕微鏡サービスラボのPablo Arielに感謝します。病理学および検査医学部門の顕微鏡サービスラボは、ノースカロライナ大学(UNC)ラインバーガー総合がんセンターへのがんセンターコアサポート助成金P30 CA016086によって部分的にサポートされています。神経科学顕微鏡コアは、助成金P30 NS045892によってサポートされています。この出版物で報告された研究は、ノースカロライナバイオテクノロジーセンターの制度的支援助成金2016-IDG-1016によって部分的にサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ブルカー 9.4T/30 cm MRI スキャナー | ブルカー バイオスペック | ホリゾンタルボア アニマル MRI システム | |
| ジベンジルエーテル | Sigma-Aldrich | 108014-1KG | |
| ジクロロメタン (DCM) | Sigma-Aldrich | 270997-1L | |
| ジメチルスルホキシド (DMSO) | フィッシャー・サイエンティフィック | ICN19605590 | |
| ロバ血清 | Sigma-Aldrich | S30-100ML | |
| EVO 860 4TB 外付け SSD | |||
| Fomblin Y | Speciality Fluids Company | YL-VAC-25-6 | パーフルオロポリエーテル潤滑剤 |
| ガドリニウム造影剤 (ProHance) | Bracco Diagnostics | A9576 | |
| ガドリニウム造影剤 (ProHance) | Bracco Diagnostics | 0270-1111-03 | |
| GeForce GTX 1080 Ti 11GB GPU | EVGA | 08G-P4-6286-KR | |
| グリシン | Sigma-Aldrich | G7126-500G | |
| ヘパリンナトリウム塩 | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | H2O to 10 mg/mL |
| 過酸化水素溶液、30% | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | |
| ImSpector Pro | LaVision BioTec | 顕微鏡画像取得ソフトウェア | |
| ITK Snap | セグメンテーションソフトウェア | ||
| Methanol | Fisher-Scientific | A412SK-4 | |
| MVPLAPO 2x/0.5 NA Objective Olympus | |||
| Paraformaldehyde, powder, 95% (PFA) | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | 1x PBS to 4% |
| Phosphate Buffered Saline 10x (PBS) | Corning | 46-013-CM | H2O |
| アジ化ナトリウム | Sigma-Aldrich | S2002-100G | H2O から 10% |
| デオキシコール酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| テルギトール型 NP-40 | Sigma-Aldrich | NP40S-100ML | |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| Tween-20 | Fisher-Scientific | BP337 500 | |
| Ultramicroscope II Light Sheet Microscope | LaVision BioTec | ||
| Xeon Processor E5-2690 v4 | Intel | E5-2690 | |
| Zyla sCMOS カメラ | Andor | 相補型金属酸化物半導体カメラ | |
| Antibody | Working concentration | ||
| Alexa Fluor Goat 790 Anti-Rabbit | Thermofisher Scientific | A11369 | (1:50) |
| Alexa Fluor Goat 568 Anti-Rat | Thermofisher Scientific | A11077 | (1:200) |
| Rat anti-Ctip2 | Abcam | ab18465 | (1:400) |
| Rabbit anti-Brn2 | Cell Signaling Technology | 12137 | (1:100) |
| To-Pro 3 (TP3) | Thermofisher Scientific | T3605 | (1分400秒) |
参考文献
- Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: Three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
- Hägerling, R., et al. A novel multistep mec....
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