ピールブロット法:多層または濃縮された生物学的サンプルから単層を分離するクライオEMサンプル調製法
Summary
ピールブロット法は、多層および濃縮された生物学的サンプルを単層に分離して、厚さを減らし、サンプル濃度を高め、画像処理を容易にするクライオEMグリッド調製法です。
Abstract
ピールブロットクライオEMグリッド調製技術は、多層サンプルの層の削減を達成することを目的として、大幅に変更されたバックインジェクション法です。急落凍結の前にこのように層を除去することで、クライオEMデータ収集に適したレベルまでサンプルの厚さを薄くし、サンプルの平坦性を改善し、画像処理を容易にすることができます。ピールブロット法により、多層膜を単層に、層状2D結晶を個々の結晶に分離し、可溶性タンパク質の積層シート状構造を同様に単層に分離することができます。これらのタイプのサンプルの厚さが高いと、特にデータ収集のために顕微鏡ステージを傾ける必要がある場合、クライオEMデータ収集およびクライオEM画像処理に克服できない問題が発生することがよくあります。さらに、グリッド調製前のサンプル濃度を高め、ピールブロット技術で単層サンプルの密な分布をもたらすように調整できるため、これらのサンプルのいずれかの高濃度のグリッドを調製して効率的なデータ収集を行うことができます。
Introduction
ピールブロット法は、膜タンパク質の積層2次元結晶を単層に分離し、クライオEM 2Dおよび3Dデータ収集に適した薄いサンプルを取得し、画像処理を容易にするために開発されました1。このプロトコルは、他のタイプの多層サンプルにも同様に適しており、Zの厚さを増やすことなく、グリッド上のいずれかのサンプルタイプの高濃度を達成するのにも適しています。
サンプル層を1層に減らすことは、毛細管圧とせん断力の組み合わせを、バックインジェクション法2に実質的に拡張して変更するプロトコルに適用することによって達成されます。最初のブロッティングステップでは、バックインジェクション法の20〜25μmのろ紙の孔径ではなく、サブミクロンでのブロッティング中に、多層サンプルの両側にあるカーボンフィルムとグリッドバーにしっかりと挟まれ、接着されます。個々の層の分離または剥離は、グリッドがトレハロースドロップに垂直に押し付けられ、炭素膜がグリッドバーから強制的に離れると、挟まれた層を強制的に分離したときに発生します(図1)。グリッドバーとの元の接触点から離れたカーボンフィルムの再配置は、グリッドがサブミクロン濾紙上で再び吸い取られる次のステップで発生します。これらのステップの反復回数は、特定のサンプルに対して最適化できます。さらに、このプロトコルは、Zでの凝集を回避しながらサンプル濃度を高めるために使用できます。 グリッドバーと炭素膜への付着、および強制的な分離に依存するため、このアプローチは、特定の繊細で不安定なタンパク質やタンパク質複合体などの非常に壊れやすい分子には適さない場合があります。
ピールブロット技術は、特殊な機器や高価な消耗品を必要としません。ただし、特定のサンプルに適用するには、生物学的パラメータを慎重に検討する必要があります。2D結晶では平坦性を確保するために炭素膜が必要であるため、決定は簡単ですが、ピールブロット法 による 操作は、サンプルの生物学的完全性または結晶秩序に影響を与える可能性があります。単一粒子に対するピールブロット技術の適合性は、炭素膜を必要とし、操作に対して安定なものに限定され、試験され得る。層間に重要な生物学的相互作用を有する標本は、そのような相互作用の破壊のために、ピールブロット技術の助けを借りての特性評価に適さない可能性があります。
ピールブロット法(「ピールブロット」)は、室温のTEMによる陰性染色または未染色サンプルでの試験およびスクリーニングによって最も迅速に最適化されます。ピールブロットの反復の最適な回数が特定されたら、ガラス化前の厚さを制御する時間を決定できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ピールブロットは、クライオ電子顕微鏡データ収集と画像処理のための多層2D結晶および類似サンプルのスタッキングと厚さを克服するための強力な方法です。ピールブロットの使用に関する決定は、サンプルの生物学的パラメータに基づいて行われ、3DクライオEMモデルが利用可能になったら評価も必要になります。接触の生物学的重要性と接触領域の潜在的な柔軟性は、この評価で特に重?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業の一部は、NIH助成金HL090630(ISK)によってサポートされました。
Materials
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
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