Hurtig optisk clearing til semi-høj gennemstrømningsanalyse af tumorsfæroider

Summary

Tumor sfæroider bliver i stigende grad brugt til at vurdere tumorcelle-mikromiljøinteraktioner og terapirespons. Den nuværende protokol beskriver en robust, men enkel metode til semi-high-throughput billeddannelse af 3D tumor sfæroider ved hjælp af hurtig optisk clearing.

Abstract

Tumor sfæroider er hurtigt ved at blive almindelige i grundlæggende kræftforskning og lægemiddeludvikling. At opnå data vedrørende proteinekspression inden for sfæroidet på celleniveau er vigtigt for analyse, men eksisterende teknikker er ofte dyre, besværlige, bruger ikke-standardudstyr, forårsager betydelig størrelsesforvrængning eller er begrænset til relativt små sfæroider. Denne protokol præsenterer en ny metode til montering og rydning af sfæroider, der løser disse problemer, samtidig med at den giver mulighed for konfokal analyse af den indre struktur af sfæroider. I modsætning til eksisterende tilgange giver denne protokol mulighed for hurtig montering og rydning af et stort antal sfæroider ved hjælp af standardudstyr og laboratorieforsyninger. Montering af sfæroider i en pH-neutral agarose-PBS-gelopløsning, før der indføres en brydningsindeksmatchet rydningsløsning, minimerer størrelsesforvrængning, der er fælles for andre lignende teknikker. Dette giver mulighed for detaljeret kvantitativ og statistisk analyse, hvor nøjagtigheden af størrelsesmålinger er altafgørende. Sammenlignet med væskerensningsløsninger holder agarosegelteknikken desuden sfæroider fastgjort på plads, hvilket muliggør indsamling af tredimensionelle (3D) konfokale billeder. Denne artikel uddyber, hvordan metoden giver to- og 3D-billeder af høj kvalitet, der giver information om variabilitet mellem celler og indre sfæroidstruktur.

Introduction

Tredimensionelle (3D) cellekulturer, såsom sfæroider, giver biologisk realistiske og reproducerbare modeller af aggregeret cellevækst ^1,2. Disse modeller er hurtigt ved at blive almindelige i både grundforskning og lægemiddeludvikling, hvor forskelle i sfæroid størrelse og struktur undersøges mellem behandlingerne for at fastslå lægemiddeleffektivitet ^3,4. I disse sammenhænge er evnen til at indsamle detaljerede oplysninger fra et stort antal sfæroider meget fordelagtig, både fra et statistisk magtperspektiv og for at muliggøre hurtig vurdering af celleadfærd på tværs af flere behandlinger.

Almindeligt anvendte teknikker til opnåelse af detaljerede mikroskopibilleder af sfæroid struktur er enten tidskrævende, dyre eller producerer billeder af dårlig kvalitet, der ikke bevarer vigtige kvantitative funktioner såsom sfæroidstørrelse ^4,5. For eksempel kan histologiske teknikker baseret på kryosektion give billeder af høj kvalitet, men er ofte tidskrævende, kræver faglært arbejdskraft og skaber ofte sektioneringsgenstande ^6,7, mens elegante teknologier, såsom enkeltplanbelysningsmikroskopi (SPIM)⁸ og multifotonmikroskopi⁹ kræver specialiserede mikroskoper, der ikke er let tilgængelige. Moderne mikroskopiteknologier har for nylig muliggjort den såkaldte optiske sektionering, hvor sfæroider placeres i en brydningsindeksmatchet clearingopløsning, og billeder opnås ved hjælp af konfokal mikroskopi ^4,5. Mens disse teknikker har potentialet til at producere et højt udbytte, omfatter almindelige problemer sfæroid bevægelse under billeddannelse, størrelsesforvrængning under rydning og den høje udgift til proprietære clearingløsninger. Desuden gælder mange eksisterende protokoller kun for relativt små sfæroider på mindre end 300 μm i diameter eller dybde op til 100 μm, hvilket begrænser teknologien til de tidlige stadier af tumorvækst ^5,10,11.

Den nuværende protokol tillader semi-high-throughput, high-yield indsamling af detaljerede sfæroidbilleder ved hjælp af en billig brydningsindeks-matchet clearingløsning afledt af hele organ clearing procedurer^12,13. For at forhindre sfæroid bevægelse under billeddannelse og give strukturel støtte for at reducere størrelsesforvrængning, er sfæroiderne monteret i agarose-PBS gel i en 24-brønd # 1.5 glasbundplade. Da denne teknik gør det muligt at montere flere sfæroider i hver brønd i en 24-brøndplade, kan op til 360 sfæroider (15 sfæroider / brønd) hurtigt monteres og afbildes på tværs af forskellige eksperimentelle forhold. En brydningsindeks-matchet rydningsløsning konstrueret af let tilgængelige forbrugsstoffer bruges til at rydde monterede sfæroider og den omgivende gel optisk. Efter en bundfældningsperiode på 24 timer giver denne protokol højkvalitets 2D- og 3D-billeder af sfæroidstruktur, selv for relativt store sfæroider (ca. 700 μm i diameter) med mindre end 2% størrelsesforvrængning.

Protocol

Protokollen beskriver fremstillingen af en tilstrækkelig mængde tumorfæroider til montering af en 24-brøndplade (ca. 240-360 sfæroider eller 10-15 sfæroider / brønd) ved 200 μL agarosegel pr. Brønd og 500 μL clearingopløsning pr. Brønd. Den fuldstændige procedure er illustreret i figur 1. 1. 2% agarose-PBS gel forberedelse Afveje 0,5 g lavsmeltende agarose (se materialetabel) i en glasflaske og tilsæt 25 ml phosphatbufferet saltvand (PBS). Smelt agarosen ved at koge opløsningen i en mikrobølgeovn i 30-60 s med låget lukket, men ikke forseglet og med konstant hvirvling. Sørg for, at agarose er helt opløst, og opløsningen ikke koger over.BEMÆRK: Gel kan opbevares ved stuetemperatur; Kontroller lydstyrken før brug for at tage højde for fordampning. Bring til flydende tilstand (mikrobølgeovn; 20-60 s med hvirvling) inden brug. 2. Forberedelse af rydningsopløsningen Afveje 9 g N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl) ethylendiamin, 22 g urinstof, 44 g saccharose, 0,1 g Triton X-100 og 24,9 g deioniseret vand (se materialetabel).BEMÆRK: Det er lettere at veje den omtrentlige mængde N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylendiamin og justere vægten af andre komponenter for at opnå den ønskede koncentration. Opløsningen opvarmes i et 56 °C vandbad med konstant blanding, og der fortsættes, indtil alle krystallerne er opløst. Hvil opløsningen ved stuetemperatur for at tillade boblerne dannet under blanding at stige til overfladen. Opløsningen er stabil ved stuetemperatur i op til 2 måneder. 3. Præparat af sfæroid Der genereres sfæroider ved hjælp af agaroseoverlejringsmetoden som tidligere beskrevet 1,3,14.BEMÆRK: Sfæroider genereret ved andre metoder er også kompatible med denne billedprotokol. Skær spidsen af en 1 ml pipettespids ved hjælp af en skalpel for at forstørre åbningen.BEMÆRK: Alle sfæroider blev håndteret med 1 ml eller 200 μL pipetter med snitspidser. Brug pipetten til at aspirere sfæroiderne fra brøndene og overføre dem til et klart 1,5 ml konisk rør. Flere sfæroider fra de samme betingelser kan kombineres i samme rør.BEMÆRK: Lad altid sfæroiderne sætte sig i bunden af røret for at aspirere mediet. Sfæroiderne vaskes i 1 ml PBS to gange, der tilsættes neutral 4 % forvarmet paraformaldehydopløsning (PFA), og sfæroider inkuberes ved 37 °C i 20 min. PFA-opløsningen fjernes, og kuglerne vaskes to gange med 1 ml PBS. 4. Sfæroid farvning Brug en pipette til at overføre op til 15 sfæroider til et 200 μL PCR-rør.BEMÆRK: For skrøbelige sfæroider monteres sfæroiderne i gel (trin 5.1-5.4), inden du fortsætter. Permeabiliser cellerne ved hjælp af 200 μL 0,5% Triton X-100 i PBS. Anbring PCR-rør inde i 50 ml skruelågrør og inkuber sfæroider i 2 timer ved stuetemperatur med mild omrøring.BEMÆRK: Alle inkubationer udføres med omrøring på en rotor, rulle eller ryster (se materialetabel), medmindre andet er angivet. Dette er vigtigt for at opnå ensartet farvning. Faste sfæroider i PBS kan undertiden klæbe til siderne af pipettespidsen. Skylning af spidsen i 0,5% Triton X-100 minimerer sfæroiderne fra at klæbe til spidserne. Opløsningen (trin 4.2) erstattes med 200 μL antistoffortyndingsbuffer (ABDIL)15 , og der inkuberes natten over ved stuetemperatur. Abdil fjernes, der tilsættes 75 μL primært antistof i ABDIL, og der inkuberes ved 4 °C i 2,5 dage. Supernatanten fjernes, og der tages 200 μL PBS med 0,1 % Tween og 0,1 % Triton X-100 (PBS-TT) to gange, og der inkuberes med 200 μL PBS-TT i 4 timer ved stuetemperatur. Pbs-TT fjernes, der tilsættes 100 μL sekundært antistof i ABDIL, og der inkuberes ved 4 °C i 2,5 dage.BEMÆRK: DAPI eller andet nukleart farvestof kan tilsættes på dette stadium. De fleste farvestoffer kræver mindre inkubationstid end antistoffer. Supernatanten fjernes, og der vaskes med 200 μL PBS-TT to gange, og der inkuberes med 200 μL PBS-TT i 4 timer. Sfæroiderne er klar til montering. 5. Montering Ved hjælp af en 200 μL pipette overføres faste og farvede sfæroider til 500 μL PCR-rør ved et rør pr. tilstand (ca. 10-15 sfæroider). Opløsningen erstattes med 200 μL 2% (w/v) flydende agarosegel og centrifugeres ved hurtig centrifugering (ved den faste maksimale hastighed, se Materialetabel) ved stuetemperatur i 30 s.BEMÆRK: Medmindre monteringen monteres med det samme, anbringes den i en varmeblok ved 50 °C for at undgå gelhærdning. Sfinér sfæroiderne i ~ 50 μL flydende agarosegel og dispenser i brønd af en 24-brønd glasbundplade. Før gelen hærder, adskilles sfæroiderne ved hjælp af en pipettespids i den omgivende gel, og sørg for, at sfæroiderne er dækket af gel. Placer eventuelt pladen på is for hurtigt at indstille gelen.BEMÆRK: Antallet af sfæroider pr. brønd afhænger af størrelsen på sfæroiderne. Sfæroider placeres langt væk fra hinanden, så kun en sfæroid kommer ind i synsfeltet under billeddannelse. Dette er vigtigt for automatiseret billedbehandling. Der tilsættes 500 μL rydningsopløsning (trin 2) pr. brønd, idet gelen er nedsænket. Der inkuberes ved RT i mindst 24 timer, og afbildes kuglerne i rydningsopløsningen. Sfæroider er stabile i denne opløsning i op til en måned ved stuetemperatur og når de er beskyttet mod fordampning. 6. Billedbehandling Vælg et mål med en arbejdsafstand, der er lang nok til at omfatte hele sfæroiden, inklusive monteringshøjden på sfæroiden i beholderen.BEMÆRK: Mål med en arbejdsafstand på 3 mm eller længere er nødvendige for at afbilde sfæroidernes ækvatoriale plan. Højere forstørrelsesmål med højere NA kan give mulighed for bedre opløsning, men vil begrænse den maksimale dybde, hvor sfæroiderne kan afbildes. For at identificere ækvatorialplanet skal du justere fokus, indtil det største overfladeareal er nået i XY-planet, og afbilde med den krævede lasereffektprocent, detektorspænding, forstærkning og forskydningsindstillinger.BEMÆRK: Lasereffektprocenten, detektorspændingen, forstærkningen og forskydningen varierer meget afhængigt af fluoroforen, farvningsintensitet, laserintensitet, detektorfølsomhed osv. For 3D-billeder skal du indstille starten og slutningen af sfæroiderne og vælge passende signalintensitet på forskellige z-dybder ved hjælp af z-intensitetskorrektionsindstillinger før billeddannelse.BEMÆRK: For at opnå den bedste billedopløsning skal du bruge Nyquist-samplinghastigheden for x, y og z (for detaljer, se reference16).

Representative Results

For at demonstrere denne clearingmetodes evne til at levere to- og tredimensionelle billeder af høj kvalitet blev sfæroider med diametre på 300-600 μm dyrket fra Fluorescent Ubiquitination-baserede Cell Cycle Indicator (FUCCI) transducerede melanomcellelinjer FUCCI-WM164 og FUCCI-WM983b 9,17 , som udtrykker monomert Kusabira Orange2 (mKO2) og monomert Azami Green -protein (mAG), når det er i henholdsvis Gap1, og den tidlige S-fase / Gap2 / mitosefase i cellecyklussen i henhold til procedurerne i trin 3 1,3,14. Sfæroiderne blev derefter fastgjort med 4% formaldehydopløsning ved 37 ° C, permeabiliseret og farvet med anti-p27kip1 / anti-kanin Alexa Fluor 647 anti-pimonidazol / anti-mus Alexa Fluor 647, DAPI eller DRAQ7 (se Materialetabel) (figur 2). Alle mikroskopifiler uploades til GitHub-lageret (https://github.com/ap-browning/SpheroidMounting). Sammenlignet med PBS-monterede sfæroider giver rydningsløsningen billeder med høj klarhed med minimal størrelsesforvrængning (figur 2A). Protokollen giver mulighed for billeddannelse i høj opløsning af detaljer på celleniveau dybere ind i sfæroiderne uden histologisk sektionering, og tværsnitsbilledet blev opnået fra et 20x luftmål (0,7 NA) med en opløsning på 4096 x 4096 px uden syning (figur 2B). Ved hjælp af en lavere forstørrelse og lavere numerisk blændemål med en længere arbejdsafstand kan der opnås 3D-konfokale billeder, der giver detaljer på celleniveau i en dybde på mindst 200 μm (figur 2C). Sfæroider blev også kryosektioneret og farvet i henhold til protokollen af Spoerri et al.4 og sammenlignet med hel sfæroidfarvning (figur 2D, E). Figur 2D viser den hypoxiske region af sfæroidet farvet af pimonidazol, og figur 2E viser p27kip1 farvning, der markerer cellecyklusstop (gul) og DAPI nuklear plet (grå). Proteinlokalisering og farvningsmønster er ens mellem kryosektion og rydning og påvirkes derfor ikke af denne rydningsmetode. Signalintensitetskorrektion i z tillader billeddannelse af hele sfæroidet. Imidlertid begrænser lysspredning på grund af den nekrotiske kerne evnen til at afbilde den anden side af sfæroiden. Dybere penetration og mindre spredning af en langt rød fluorofor, såsom DRAQ7 nuklear plet, giver mulighed for endnu yderligere forbedret 3D-sfæroid strukturrepræsentation (figur 3). Film 1 viser 3D-gengivelsen af FUCCI-sfæroiderne farvet med DRAQ7. En tyndere z-skive kan give mulighed for bedre z-opløsning, men dette øger billeddannelsestiden og fotobleaching af fluoroforerne betydeligt. For at afgøre, om rydningsopløsningen forårsager størrelsesforvrængning, blev tolv sfæroider i 2% agarose-PBS-gel afbildet ved 6 timer, 12 timer, 24 timer, 72 timer og 168 timer efter indførelsen af rydningsopløsningen. Billederne blev opsummeret ved at bestemme diameteren af sfæroiden, defineret ud fra en kugle med samme tværsnitsareal som sfæroidet (figur 4A). Mens sfæroiderne observeres at stige lidt i størrelse i løbet af de første 6 timer, indikeret ved en diameter foldeændring på mellem 2% og 6% (figur 4B), vender sfæroiderne efter 24 timer til 72 timer tilbage til en størrelse, der omtrent svarer til den tilsvarende størrelse i PBS efter PFA-fiksering (figur 4C). Figur 1: Illustration af den sfæroide monterings- og rydningsprotokol. Faste og farvede sfæroider overføres til et 500 μL rør; overskydende væske erstattes af 200 μL agarose-PBS gel og centrifugeres. Sfæroider overføres derefter til en glasbundet brønd i en 24-brøndplade. Efter at gelen er tilladt at størkne, tilsættes 500 μL rydningsopløsning, og sfæroider får lov til at afbalancere. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Sammenligning af ryddede og uklare FUCCI humane melanom sfæroider. Farvning indikerer cellekerner positive for mKO2 (rød), hvilket indikerer celler i hul 1; og cellekerner positive for mAG (grøn), hvilket indikerer celler i hul 2. (A) Sfæroider dyrket af 5000 FUCCI-WM983b-celler, høstet på dag 10 og afbildet i agarose-PBS-gel og 24 timer efter rydning af opløsning tilsættes. Sammenligning af brightfield- og konfokalbilleder før og efter rydning af opløsning viser minimal størrelsesforvrængning og en stor gevinst i klarhed. Billeder opnås ved hjælp af et 10x mål. (B) Sfæroider dyrket af FUCCI-WM164-celler permeabiliseret ved hjælp af Triton X-100 og farvet med DRAQ7, farvning af alle cellekerner. Billedet opnås ved hjælp af et 20x mål (0,75 NA), der viser, at clearingløsningen muliggør billeddannelse i høj opløsning af celleniveaudetaljer. (C) 3D-billeder (10x, 0,4 NA) blev opnået af FUCCI-WM164-sfæroider i PBS og 24 timer efter, at clearingopløsningen blev tilføjet. Justering af lasereffekt, spænding og forskydning ved forskellige z-planer muliggør billeddannelse dybere inde i sfæroidet. (D,E) Sammenligning mellem kryosektion og ryddet hel sfæroid farvet for pimonidazol og p27kip1. (D) Pimonidazolfarvning i magenta viser den hypoxiske region i sfæroiderne. Rød og grøn angiver FUCCI. (E) Kryosections og cleared sfæroid, der viser DAPI (grå) og p27kip1 (gul). Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3: Rydning giver mulighed for billeddannelse dybere ind i sfæroidet med minimalt lystab. Konfokale mikroskopibilleder af en FUCCI human melanom sfæroid ved 10x forstørrelse og lavere NA (0,4), hvilket muliggør billeddannelse ved højere z-dybde med minimalt signaltab. (A) 3,88 μm skiver af sfæroidkerner farvet med DRAQ7. (B-D) y / z-opløsning i henholdsvis 488 (mAG), 568 (mKO2) og 647 nm (DRAQ7) kanaler. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 4: Rydning af opløsning har minimal indvirkning på sfæroid størrelse. (A) Fordeling af initial sfæroidstørrelse (ækvivalent diameter) i PBS-gel (n = 12 sfæroider). (B) Diameter foldeændring over tid siden tilsætning af rydningsopløsning. Ved 0 timer er sfæroider kun i PBS-gel. (C) Fordeling af diameter foldeændringer ved 12 timer, 24 timer og 72 timer. Klik her for at se en større version af denne figur. Film 1: 3D-gengivelse af en FUCCI-sfæroid farvet med DRAQ7. Klik her for at downloade denne film.

Discussion

En protokol til opnåelse af to- og tredimensionelle billeder af tumorfæroider af høj kvalitet præsenteres her. Eksisterende metoder, såsom CLARITY, See deep brain (SeeDB) og ScaleS, forårsager ofte størrelsesforvrængning med op til 30%, mens teknikker som Benzylalkohol / Benzylbenzoat (BABB) og 3D-billeddannelse af opløsningsmiddel-rensede organer (3DISCO) kan slukke fluorescerende protein¹⁸. Mange af disse metoder er designet til at rydde væv med strukturel integritet og forvrænge størrelsen og strukturen, når de påføres sfæroider¹⁸. I modsætning til andre protokoller, der bruger kommercielt tilgængelige dyre clearingløsninger, bruger denne protokol let tilgængelige forbrugsstoffer, samtidig med at optisk klarhed og endogen fluorescens opretholdes og minimerer størrelsesforvrængning. Indlejring af sfæroider i agarose-PBS gel giver strukturel støtte til sfæroider og minimerer osmotisk stød, når rydningsopløsningen tilsættes. Dette er afgørende ved billeddannelse af skrøbelige sfæroider efter lægemiddelbehandling. Det antages, at denne optiske clearingmetode er egnet til sfæroider dannet ved enhver metode, da denne protokol er tilpasset fra helvævsrensning. Antagelsen er baseret på ligheden i sfæroiderne opnået ved forskellige sfæroiddannelsesmetoder. Valget af fikseringsmiddel kan påvirke sfæroidstørrelsen såvel som endogen fluorescens. Denne clearingmetode er velegnet til sfæroider fastgjort med neutral 4% PFA-opløsning. Yderligere test er påkrævet for at kontrollere dens kompatibilitet med andre fikseringsmidler.

I betragtning af at denne teknik gør det muligt at montere flere sfæroider samtidigt i en multi-well plade, er den velegnet til kvantitative analyserørledninger, der kræver sfæroidstrukturinformation fra op til 360 sfæroider pr. 24-brøndplade. Mikroskoper med automatiserede trin- og pladekortlægningsfunktioner kan gøre billeddannelse mindre manuel. Selvom denne metode er hurtigere og lettere end sektionering, er den i øjeblikket uegnet til fuldstændig automatisering. Imidlertid er billeder opnået ved denne metode egnede til automatiseret billedbehandling ^4,19, og den hastighed, hvormed sfæroider kan monteres ved hjælp af denne protokol, giver mulighed for kvantitativ analyse af sfæroid indre struktur 20,21,22.

Til farvning af hele sfæroider skal antistofkoncentrationen, volumenet og inkubationstiden optimeres for hvert antistof. Som vejledning skal du bruge 2,5x af den anbefalede 2D immunofluorescensantistofkoncentration og 100-200 μL antistof afhængigt af antallet af sfæroider pr. Rør. Sørg for, at alle sfæroider er dækket af farvningsopløsning, når de er på rotoren. Inkubationstiden afhænger af mange faktorer, herunder størrelsen og densiteten af sfæroider og antistoffet, og kan variere fra 16-72 timer. På trods af at metoden muliggør signaldetektion dybere inde i sfæroidet, forårsager fluorophorer, der er ophidset af UV, betydelig lysspredning, hvilket fører til et lavt signal-støj-forhold. Der skal udvises forsigtighed, når du vælger fluorophorer til at visualisere målproteinet. For eksempel vil farvning af mindre rigelige og strukturelle proteiner med fluoroforer med længere bølgelængde og mere rigelige protein- eller nukleare pletter med fluoroforer med kortere bølgelængde opnå det bedste resultat. Endelig viser ryddede sfæroider stadig lystab på grund af spredning i den nekrotiske kerne, hvilket fremgår af y / z-dimensionen af billeder opnået af 600 μm sfæroider (figur 2C).

Højere forstørrelsesbilleddannelse med højere NA-mål er mulig med sfæroider monteret og ryddet ved hjælp af denne protokol, men målets arbejdsafstand begrænser billeddybden. For en olie nedsænkning linse er det vigtigt at bruge olie, der har en RI på 1,51 for det bedste resultat.

For at opsummere giver agarose-PBS gel indlejret clearing metode mulighed for visualisering af celler dybt inde i sfæroider ved hjælp af almindeligt tilgængelige forbrugsstoffer. Sfæroider monteret og ryddet ved hjælp af denne metode gennemgår minimal størrelsesforvrængning og opretholder deres strukturelle integritet, hvilket muliggør indsamling af data af høj kvalitet vedrørende den indre sfæroidstruktur og efterfølgende automatiseret kvantificering.

Materials

#1.5 glass bottom 24-well plate	Celvis	P24-1.5H-N
500 µL clear PCR tubes	Sigma	HS4422
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immuno research	715-605-151	Dilution used 1:500
Bovine serum albumin	Sigma	A7906	Final concentration 2% w/v
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Final concentration 5 µg/mL
Deionized water	MILLI Q
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Thermofisher	A-31573	Dilution used 1:500
DRAQ7	Thermofisher	D15106	Dilution used 1:250
Heating block	Ratek	DBH10	or similar equipment
Hypoxyprobe Kits	Hypoxyprobe	HP1-1000Kit	Antibody dilution used 1:500
Low-melting agarose powder	Sigma	A9414	Final concentration 2% w/v
Microwave	Sharp
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine	Sigma	122262	Final concentration 9% w/w
NaCl	Sigma	S9888	Final concentration 150 mM
NaN3	Sigma	S2002	Final concentration 0.10% w/v
p27 Kip1 (D69C12) XP	Cell Signalling technology	3686S	Dilution used 1:500
Paraformaldehyde solution	Proscitech	C004	Final concentration 4% w/v
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermofisher	18912014	Final concentration 1x
Pipette	Eppendorf
Quickspin minifuge			or similar equipment
Roller	Ratek	BTR10-12V	or similar equipment
Rotor	Ratek	RSM7DC	or similar equipment
Shaker	Ratek	EOM5	or similar equipment
Sucrose	Sigma	S9378	Final concentration 44% w/w
Tris-HCl pH 7.4	Sigma	T5941	Final concentration 20 mM
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.10% v/v
Triton X-100	Sigma	X100	Final concentration 0.1% v/v
Tween 20	Sigma	P1379	Final concentration 0.1% v/v
Urea	Sigma	U5379	Final concentration 22% w/w