मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से छोटे बाह्य पुटिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल बेंचटॉप निस्पंदन विधि
Summary
यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक सरल प्रयोगशाला-स्केल बेंचटॉप सेटिंग के साथ मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं के छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को कैसे अलग किया जाए। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी के आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एसईवी मार्कर और आकृति विज्ञान क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा विशेषता है।
Abstract
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित प्रक्रिया को छोटे बाह्य पुटिकाओं (एसईवी) अलगाव के लिए सामान्य विधि माना जाता है। हालांकि, इस अलगाव विधि से उपज अपेक्षाकृत कम है, और ये विधियां एसईवी उपप्रकारों को अलग करने में अक्षम हैं। यह अध्ययन मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी छोटे बाह्य पुटिकाओं (एचयूसी-एमएससी-एसईवी) को अलग करने के लिए एक सरल बेंचटॉप निस्पंदन विधि को प्रदर्शित करता है, जो एचयूसी-एमएससी के वातानुकूलित माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा सफलतापूर्वक अलग किया जाता है। आकार वितरण, प्रोटीन एकाग्रता, एक्सोसोमल मार्कर (सीडी 9, सीडी 81, टीएसजी 101), और पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी की आकृति विज्ञान को क्रमशः नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण, बीसीए प्रोटीन परख, पश्चिमी धब्बा और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया गया था। पृथक एचयूसी-एमएससी-एसईवी का आकार 30-200 एनएम था, जिसमें 7.75 × 10 10 कण / एमएल की कण एकाग्रता और80 μg / mL की प्रोटीन एकाग्रता थी। एक्सोसोमल मार्कर सीडी 9, सीडी 81 और टीएसजी 101 के लिए सकारात्मक बैंड देखे गए। इस अध्ययन से पता चला है कि एचयूसी-एमएससी-एसईवी को सफलतापूर्वक एचयूसी-एमएससी वातानुकूलित माध्यम से अलग किया गया था, और लक्षण वर्णन से पता चला है कि पृथक उत्पाद एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स 2018 (एमआईएसईवी 2018) के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी द्वारा उल्लिखित मानदंडों को पूरा करता है।
Introduction
एमआईएसईवी 2018 के अनुसार, एसईवी गैर-प्रतिकृति लिपिड बाइलेयर कण हैं जिनमें कोई कार्यात्मक नाभिक मौजूद नहीं है, जिसका आकार 30-200 एनएम1 है। एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी में महत्वपूर्ण सिग्नलिंग अणु होते हैं जो ऊतक पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि माइक्रोआरएनए, साइटोकिन्स या प्रोटीन। वे पुनर्योजी चिकित्सा और सेल-मुक्त चिकित्सा में तेजी से एक शोध “हॉटस्पॉट” बन गए हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी विभिन्न स्थितियों के इलाज में एमएससी के रूप में प्रभावी हैं, जैसे कि इम्यूनोमॉड्यूलेशन 2,3,4,5, ओस्टियोजेनेसिस6 को बढ़ाना, मधुमेह मेलेटस 7,8, या संवहनी पुनर्जनन 9,10। जैसे-जैसे शुरुआती चरण के परीक्षण आगे बढ़ते हैं, एमएससी-ईवी के नैदानिक अनुवाद के संबंध में तीन मुख्य प्रमुख मुद्दों पर प्रकाश डाला गया है: ईवी की उपज, ईवी की शुद्धता (सेल मलबे और प्रोटीन और साइटोकिन्स जैसे अन्य जैविक दूषित पदार्थों से मुक्त), और अलगाव के बाद ईवी के फॉस्फोलिपिड बाइलेयर झिल्ली की अखंडता।
एसईवी11 के घनत्व, आकार, आकार और सतह प्रोटीन का दोहन करते हुए एसईवी को अलग करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए गए हैं। एसईवी अलगाव में दो सबसे आम तरीके अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित और अल्ट्राफिल्ट्रेशन-आधारित तकनीकहैं।
अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन-आधारित विधियों को एसईवी अलगाव में स्वर्ण मानक तरीके माना जाता है। आमतौर पर नियोजित दो प्रकार की अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीकें अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन हैं। हालांकि, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों के परिणामस्वरूप अक्सर कम उपज होती है और उच्च गति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज (100,000-200,000 × ग्राम) के लिए महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन तकनीक अकेले ईवी उपप्रकारों (एसईवी और बड़े ईवी) को अलग करने में अक्षम हैं, जिसके परिणामस्वरूप एक अशुद्ध तलछट परत11 होती है। अंत में, घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन भी समय लेने वाला हो सकता है और त्वरण औरमंदी के चरणों के दौरान ढाल क्षति को रोकने के लिए सुक्रोज बफर एडिशन जैसे अतिरिक्त एहतियाती कदमों की आवश्यकता होती है। इसलिए, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन आमतौर पर अपेक्षाकृत कम उपज की ओर जाता है और ईवी13 की विभिन्न आबादी के बीच भेदभाव करने में सक्षम नहीं है, जो बड़े पैमाने पर ईवी तैयारीके लिए इसके आवेदन को सीमित करता है।
ईवी अलगाव की दूसरी विधि अल्ट्राफिल्ट्रेशन के माध्यम से है, जो आकार निस्पंदन पर आधारित है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में अल्ट्राफिल्ट्रेशन अपेक्षाकृत समय और लागत प्रभावी है, क्योंकि इसमें महंगे उपकरण या लंबे प्रसंस्करण समयशामिल नहीं हैं। इसलिए, अल्ट्राफिल्ट्रेशन उपरोक्त दोनों अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन विधियों की तुलना में एक अधिक प्रभावी अलगाव तकनीक प्रतीत होती है। पृथक उत्पाद छिद्र आकार और उच्च उपजके आधार पर अधिक विशिष्ट हो सकते हैं। हालांकि, निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान किए गए अतिरिक्त बल के परिणामस्वरूप ईवी16 का विरूपण या विस्फोट हो सकता है।
वर्तमान पेपर ने डाउनस्ट्रीम विश्लेषण और चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए एमएससी-व्युत्पन्न एसईवी को अलग करने के लिए एक लागत और समय प्रभावी बेंचटॉप प्रोटोकॉल का प्रस्ताव दिया। इस पेपर में वर्णित विधि ने कण आकार विश्लेषण, बायोमार्कर परख और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग सहित डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए एचयूसी-एमएससी से उच्च उपज और अच्छी गुणवत्ता वाले ईवी को अलग करने के लिए बेंच टॉप सेंट्रीफ्यूजेशन के साथ एक सरल निस्पंदन विधि को जोड़ा।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईवी एमएससी में स्राव के महत्वपूर्ण उपसमुच्चय में से एक हैं जो सामान्य और रोग प्रक्रियाओं के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, 30 से 200 एनएम के बीच आकार सीमा वाले एसईवी, पिछले दशक में सेल-मुक्त ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस वीडियो के प्रकाशन को My CytoHealth Sdn. Bhd द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 40% acrylamide | Nacalai Tesque | 06121-95 | Western blot |
| 95% ethanol | Nacalai Tesque | 14710-25 | Disinfectants |
| Absolute Methanol | Chemiz | 45081 | To activate PVDF membrane (Western blot) |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Cell dissociation enzyme |
| ammonium persulfate | Chemiz | 14475 | catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis |
| anti-CD 81 (B-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | Antibody for sEVs marker |
| anti-TSG 101 (C-2) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7964 | Antibody for sEVs marker |
| Bovine serum albumin | Nacalai Tesque | 00653-31 | PVDF membrane blocking |
| bromophenol blue | Nacalai Tesque | 05808-61 | electrophoretic color marker |
| Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) | Millipore | UFC710008 | sEVs isolation |
| ChemiLumi One L | Nacalai Tesque | 7880 | chemiluminescence detection reagent |
| CryoStor Freezing Media | Sigma-Aldrich | C3124-100ML | Cell cryopreserve |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | Nacalai Tesque | 08458-45 | Cell culture media |
| ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker | SMOBIO | PM2610 | Protein molecular weight markers |
| Extra thick blotting paper | ATTO | buffer reservior (Western blot) | |
| Glycerol | Merck | G5516 | Chemicals for western blot |
| Glycine | 1st Base | BIO-2085-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) | Santa Cruz Biotechnology | sc-516102 | Secondary antibody (Western Blot) |
| Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia | ||
| mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13118 | Antibody for sEVs marker |
| Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 | Malvern Panalytical, UK | ||
| paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 02890-45 | Sample Fixation during TEM |
| penicillin–streptomycin | Nacalai Tesque | 26253-84 | Antibiotic for media |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Nacalai Tesque | 27327-81 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| phosphate-buffered saline | Gibco | 10010023 | Washing, sample dilution |
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with 0.45 mm pore size |
ATTO | To hold protein during protein transfer (Western blot) | |
| protease inhibitor cocktail | Nacalai Tesque | 25955-11 | Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer |
| Protein Assay Bicinchoninate Kit | Nacalai Tesque | 06385-00 | Protein measurement |
| sample buffer solution with 2-ME | Nacalai Tesque | 30566-22 | Reducing agent for western blot |
| sodium chloride | Nacalai Tesque | 15266-64 | Chemicals for western blot |
| sodium dodecyl sulfate | Nacalai Tesque | 31606-62 | ionic surfactant during gel electrophoresis |
| Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope | FEI, USA | ||
| tetramethylethylenediamine | Nacalai Tesque | 33401-72 | chemicals to prepare gel |
| tris-base | 1st Base | BIO-1400-500g | Chemicals for buffer (Western Blot) |
| Tween 20 | GeneTex | GTX30962 | Chemicals for western blot |
| UVP (Ultra Vision Product) CCD imager | CCD imager for western blot signal detection |
References
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