Summary

En enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere små ekstracellulære vesikler fra humane mesenkymale stamceller

Published: June 23, 2022
doi:

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan man isolerer humane navlestrengsavledede mesenkymale stamcellers små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) med en enkel benkeplateinnstilling i laboratorieskala. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, sEVs markører og morfologi av isolerte hUC-MSC-sEVs er preget av henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop.

Abstract

Den ultrasentrifugeringsbaserte prosessen regnes som den vanlige metoden for isolasjon av små ekstracellulære vesikler (sEVs). Utbyttet fra denne isolasjonsmetoden er imidlertid relativt lavere, og disse metodene er ineffektive for å skille sEV-undertyper. Denne studien demonstrerer en enkel stasjonær filtreringsmetode for å isolere MSC små ekstracellulære vesikler (hUC-MSC-sEVs) fra mennesker, vellykket separert ved ultrafiltrering fra det kondisjonerte mediet til hUC-MSC. Størrelsesfordelingen, proteinkonsentrasjonen, eksosomale markører (CD9, CD81, TSG101) og morfologien til de isolerte hUC-MSC-sEVene ble karakterisert med henholdsvis nanopartikkelsporingsanalyse, BCA-proteinanalyse, western blot og transmisjonselektronmikroskop. De isolerte hUC-MSC-sEVs størrelse var 30-200 nm, med en partikkelkonsentrasjon på 7,75 × 10 10 partikler/ml og en proteinkonsentrasjon på80 μg/ml. Positive bånd for eksosomale markører CD9, CD81 og TSG101 ble observert. Denne studien viste at hUC-MSC-sEVs ble vellykket isolert fra hUC-MSCs betingede medium, og karakterisering viste at det isolerte produktet oppfylte kriteriene nevnt av Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV 2018).

Introduction

I følge MISEV 2018 er sEV ikke-replikerende lipid-dobbeltlagspartikler uten funksjonell kjerne tilstede, med en størrelse på 30-200 nm1. MSC-avledede sEV-er inneholder viktige signalmolekyler som spiller viktige roller i vevregenerering, for eksempel mikroRNA, cytokiner eller proteiner. De har i økende grad blitt et forsknings-“hotspot” innen regenerativ medisin og cellefri terapi. Mange studier har vist at MSC-avledede sEV-er er like effektive som MSC ved behandling av forskjellige forhold, for eksempel immunmodulering 2,3,4,5, forsterkende osteogenese 6, diabetes mellitus 7,8 eller vaskulær regenerering 9,10. Etter hvert som forsøkene i tidlig fase skrider frem, har tre hovednøkkelspørsmål i forhold til den kliniske oversettelsen av MSC-EV-er blitt fremhevet: utbyttet av elbilene, renheten til elbilene (fri for cellerester og andre biologiske forurensninger som protein og cytokiner) og integriteten til fosfolipid-dobbeltlagsmembranen til elbilene etter isolering.

Ulike metoder har blitt utviklet for å isolere sEVs, utnytte tettheten, formen, størrelsen og overflateproteinet til sEVs11. De to vanligste metodene i sEV-isolasjoner er ultrasentrifugeringsbaserte og ultrafiltreringsbaserte teknikker.

Ultrasentrifugeringsbaserte metoder regnes som gullstandardmetoder i sEVs isolasjon. To typer ultracentrifugation teknikker som vanligvis brukes er differensiell ultracentrifugation og tetthet gradient ultracentrifugation. Imidlertid resulterer ultrasentrifugeringsmetoder ofte i lavt utbytte og krever dyrt utstyr for høyhastighets ultrasentrifuge (100.000-200.000 × g)11. Videre er ultrasentrifugeringsteknikker alene ineffektive for å separere EV-subtyper (sEV og store EV), noe som resulterer i et urent sedimentlag11. Til slutt kan ultrasentrifugering av tetthetsgradient også være tidkrevende og kreve ytterligere forholdsregler som sukrosebuffertillegg for å hemme gradientskaden under akselerasjon og retardasjonstrinn12. Derfor fører ultrasentrifugering vanligvis til et relativt lavt utbytte og er ikke i stand til å diskriminere mellom forskjellige populasjoner av EV13, noe som begrenser søknaden om storskala EV-forberedelse11.

Den andre metoden for EV-isolasjon er via ultrafiltrering, som er basert på størrelsesfiltrering. Ultrafiltrering er relativt tids- og kostnadseffektivt sammenlignet med ultrasentrifugering, da det ikke innebærer dyrt utstyr eller lang saksbehandlingstid14. Derfor synes ultrafiltrering å være en mer effektiv isolasjonsteknikk enn begge de nevnte ultrasentrifugeringsmetodene. De isolerte produktene kan være mer spesifikke basert på porestørrelser og høyere utbytte15. Den ekstra kraften som påløper under filtreringsprosessen kan imidlertid føre til deformasjon eller utbrudd av elbilene16.

Det nåværende papiret foreslo en kostnads- og tidseffektiv benchtop-protokoll for isolering av MSC-avledede sEV-er for nedstrømsanalyse og terapeutiske formål. Metoden beskrevet i dette papiret kombinerte en enkel filtreringsmetode med benksentrifugering for å isolere høy avkastning og god kvalitet EV fra hUC-MSCs for nedstrømsanalyse, inkludert partikkelstørrelsesanalyse, biomarkøranalyse og elektronmikroskopisk avbildning.

Protocol

MERK: Se materialfortegnelsen for detaljer om alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen. 1. Human navlestreng, mesenkymale stamceller og kultur Dyrkning av hUC-MSC ved en såtetthet på 5 × 103/cm2 i DMEM, supplert med 8 % humant blodplatelysat og 1 % pen-streptokokker. Inkuber cellene ved 37 °C i 5% CO2. Bytt ut cellekulturmediet hver 3. dag for å sikre riktig cellevekst. Utvi…

Representative Results

Figur 2 viser at hUC-MSC-sEV har en partikkelstørrelsesmodus ved 53 nm, mens andre signifikante topper av partikkelstørrelse var 96 og 115 nm. Konsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt av NTA var 7,75 × 1010 partikler/ml. Proteinkonsentrasjonen av hUC-MSC-sEVs målt med BCA-analysen var ca. 80 μg / ml. I vestlig blottinganalyse viste hUC-MSC-sEV positive bånd for eksosommarkørene CD9, CD81 og TSG101, men var negative for GRP94 (fi…

Discussion

Elbiler er en av de viktige undergruppene av sekretomet i MSC som spiller en avgjørende rolle under normale og patologiske prosesser. Imidlertid har sEV, med et størrelsesområde mellom 30 og 200 nm, steget som et potensielt verktøy for cellefri terapi det siste tiåret. Ulike teknikker ble utviklet for å isolere sEV-er fra MSC-er. Imidlertid har differensiell ultrasentrifugering, ultrafiltrering, polymerbasert nedbør, immunoaffinitetsfangst og mikrofluidikkbasert nedbør forskjellige fordeler og ulemper<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Publiseringen av denne videoen ble støttet av My CytoHealth Sdn. Bhd.

Materials

40% acrylamide Nacalai Tesque 06121-95 Western blot
95% ethanol Nacalai Tesque 14710-25 Disinfectants
Absolute Methanol Chemiz 45081 To activate PVDF membrane (Western blot)
Accutase STEMCELL Technologies 7920 Cell dissociation enzyme
ammonium persulfate Chemiz 14475 catalyse the gel polymerisation (Gel electrophoresis
anti-CD 81 (B-11) Santa Cruz Biotechnology sc-166029 Antibody for sEVs marker
anti-TSG 101 (C-2) Santa Cruz Biotechnology sc-7964 Antibody for sEVs marker
Bovine serum albumin Nacalai Tesque 00653-31 PVDF membrane blocking
bromophenol blue Nacalai Tesque 05808-61 electrophoretic color marker
Centricon Plus-70 (100 kDa NMWL) Millipore UFC710008 sEVs isolation
ChemiLumi One L Nacalai Tesque 7880 chemiluminescence detection reagent
CryoStor Freezing Media Sigma-Aldrich C3124-100ML Cell cryopreserve
Dulbecco’s modified Eagle’s medium Nacalai Tesque 08458-45 Cell culture media
ExcelBand Enhanced 3-color High Range Protein Marker SMOBIO PM2610 Protein molecular weight markers
Extra thick blotting paper ATTO buffer reservior (Western blot)
Glycerol Merck G5516 Chemicals for western blot
Glycine 1st Base BIO-2085-500g Chemicals for buffer (Western Blot)
horseradish peroxidase-conjugated mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκBP-HRP) Santa Cruz Biotechnology sc-516102 Secondary antibody (Western Blot)
Human Wharton’s Jelly derived Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Centre for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Faculty of Medicine, The National University Malaysia
mouse antibodies anti-CD 9 (C-4) Santa Cruz Biotechnology  sc-13118 Antibody for sEVs marker
Nanosight NS300 equipped with a CMOS camera, a 20 × objective lens, a blue laser module (488 nm), and NTA software v3.2 Malvern Panalytical, UK
paraformaldehyde Nacalai Tesque 02890-45 Sample Fixation during TEM
penicillin–streptomycin Nacalai Tesque 26253-84 Antibiotic for media
phenylmethylsulfonyl fluoride Nacalai Tesque 27327-81 Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
phosphate-buffered saline Gibco 10010023 Washing, sample dilution
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane with
0.45 mm pore size
ATTO To hold protein during protein transfer (Western blot)
protease inhibitor cocktail Nacalai Tesque 25955-11 Inhibit proteases in the sEVs samples after adding lysis buffer
Protein Assay Bicinchoninate Kit Nacalai Tesque 06385-00 Protein measurement
sample buffer solution with 2-ME Nacalai Tesque 30566-22 Reducing agent for western blot
sodium chloride Nacalai Tesque 15266-64 Chemicals for western blot
sodium dodecyl sulfate Nacalai Tesque 31606-62 ionic surfactant during gel electrophoresis
Tecnai G2 F20 S-TWIN transmission electron microscope FEI, USA
tetramethylethylenediamine Nacalai Tesque 33401-72 chemicals to prepare gel
tris-base 1st Base BIO-1400-500g Chemicals for buffer (Western Blot)
 Tween 20 GeneTex GTX30962 Chemicals for western blot
UVP (Ultra Vision Product) CCD imager CCD imager for western blot signal detection

References

  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  2. Jayabalan, N., et al. Cross talk between adipose tissue and placenta in obese and gestational diabetes mellitus pregnancies via exosomes. Frontiers in Endocrinology. 8, 239 (2017).
  3. Li, T., et al. Exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate liver fibrosis. Stem Cells and Development. 22 (6), 845-854 (2013).
  4. Wang, C., et al. Mesenchymal stromal cell-derived small extracellular vesicles induce ischemic neuroprotection by modulating leukocytes and specifically neutrophils. Stroke. 51 (6), 1825-1834 (2020).
  5. Wei, Y., et al. MSC-derived sEVs enhance patency and inhibit calcification of synthetic vascular grafts by immunomodulation in a rat model of hyperlipidemia. Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  6. Liu, W., et al. MSC-derived small extracellular vesicles overexpressing miR-20a promoted the osteointegration of porous titanium alloy by enhancing osteogenesis via targeting BAMBI. Stem Cell Research and Therapy. 12 (1), 1-16 (2021).
  7. Li, F. X. Z., et al. The role of mesenchymal stromal cells-derived small extracellular vesicles in diabetes and its chronic complications. Frontiers in Endocrinology. 12, 1741 (2021).
  8. Jayabalan, N., et al. . Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
  9. Wei, Y., et al. . Biomaterials. 204, 13-24 (2019).
  10. Du, W., et al. Enhanced proangiogenic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes stimulated by a nitric oxide releasing polymer. Biomaterials. 133, 70-81 (2017).
  11. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  12. Nicolas, R. H., Goodwin, G. H. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
  13. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  14. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocol. 2015 (4), 319-323 (2015).
  15. Kırbaş, O. K., et al. Optimized isolation of extracellular vesicles from various organic sources using aqueous two-phase system. Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).
  16. Ev, B., Ms, K. Using exosomes, naturally-equipped nanocarriers, for drug delivery. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 219, 396-405 (2015).
  17. Dragovic, R. A., et al. Isolation of syncytiotrophoblast microvesicles and exosomes and their characterisation by multicolour flow cytometry and fluorescence Nanoparticle Tracking Analysis. Methods. 87, 64-74 (2015).
  18. Tan, K. L., et al. Benchtop isolation and characterisation of small extracellular vesicles from human mesenchymal stem cells. Molecular Biotechnology. 63 (9), 780-791 (2021).

Play Video

Cite This Article
Koh, B., Tan, K. L., Chan, H. H., Daniel Looi, Q. H., Lim, M. N., How, C. W., Law, J. X., Foo, J. B. A Simple Benchtop Filtration Method to Isolate Small Extracellular Vesicles from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (184), e64106, doi:10.3791/64106 (2022).

View Video