Her beskriver vi en protokol, der kombinerer adeno-associeret virusinjektion med kranial vinduesimplantation til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus.
Da hjernefunktioner er under kontinuerlig påvirkning af de signaler, der stammer fra perifert væv, er det afgørende at belyse, hvordan gliaceller i hjernen registrerer forskellige biologiske forhold i periferien og transmitterer signalerne til neuroner. Microglia, immunceller i hjernen, er involveret i synaptisk udvikling og plasticitet. Derfor bør mikroglia’s bidrag til neurale kredsløbskonstruktioner som reaktion på kroppens indre tilstand testes kritisk ved intravital billeddannelse af forholdet mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet.
Her beskriver vi en teknik til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus. Adeno-associeret virus, der koder for R-CaMP, en genkodet calciumindikator for rødt fluorescensprotein, blev injiceret i lag 2/3 af den primære visuelle cortex i CX3CR1-EGFP transgene mus, der udtrykker EGFP i mikroglia. Efter viral injektion blev et kranievindue installeret på hjerneoverfladen i det injicerede område. In vivo to-foton-billeddannelse i vågne mus 4 uger efter operationen viste, at neural aktivitet og mikroglial dynamik kunne registreres samtidigt ved sub-sekund temporal opløsning. Denne teknik kan afdække koordineringen mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet, hvor førstnævnte reagerer på perifere immunologiske tilstande, og sidstnævnte koder for de indre hjernetilstande.
Der er voksende tegn på, at kroppens indre tilstand konstant påvirker hjernefunktionerne hos dyr 1,2,3,4,5. For at få en dybere forståelse af hjernens funktioner er det derfor afgørende at belyse, hvordan gliaceller i hjernen overvåger biologiske forhold i periferien og videregiver informationen til neuroner.
Microglia, immunceller i hjernen, er involveret i synaptisk udvikling og plasticitet, som skulpturerer karakteristika for neurale kredsløb i hjernen 6,7,8,9. For eksempel viste pionerarbejdet af Wake et al., at mikrogliale processer kommer i kontakt med synapser på en neuronal aktivitetsafhængig måde i musens neocortex, og at kunstig iskæmi inducerer synapsetab efter langvarig kontakt med microglia10. Tremblay et al. fandt, at ændring af visuel oplevelse ændrer modaliteten af mikroglial interaktion med synapser. I den kritiske periode, hvor dendritisk rygsøjleomsætning i den primære visuelle cortex (V1) øges ved kikkertmangel, reducerer mørk tilpasning motiliteten af mikrogliale processer og øger både deres kontaktfrekvens med synaptiske kløfter og antallet af cellulære indeslutninger i mikroglia11. Disse resultater tyder på, at mikrogliale processer registrerer neural aktivitet og deres omgivende miljø for at ombygge neurale kredsløb. Desuden rapporterede en nylig undersøgelse, at mikroglial overvågning adskiller sig mellem vågne og bedøvede tilstande, hvilket tyder på vigtigheden af eksperimenter med vågne mus til undersøgelse af neuron-mikroglia-kommunikation under fysiologiske forhold12.
In vivo to-foton calciumbilleddannelse er et kraftfuldt værktøj til registrering af calciumdynamik, der afspejler igangværende neuronal fyring, i hundredvis af neuroner samtidigt i et levende dyr13,14,15. Calciumbilleddannelse i neuroner kræver generelt en tidsmæssig opløsning på mere end et par Hz for at spore hurtige neuronale reaktioner16,17. I modsætning hertil har tidligere undersøgelser, der sporer mikroglial dynamik, samplet mikrogliale strukturer ved en relativt lav tidsopløsning på mindre end 0.1 Hz18,19,20. En nylig undersøgelse anvendte samtidig to-foton-billeddannelse til at forstå neuron-mikroglia-kommunikation21. Det er dog stadig uklart, hvordan dynamiske mikrogliale processer reagerer på den omgivende neurale aktivitet ved en tidsmæssig opløsning på mere end et par Hz hos vågne mus. For at løse dette problem beskriver vi en samtidig in vivo to-foton-billeddannelsesmetode til neural aktivitet og mikroglial dynamik med en tidsmæssig opløsning højere end 1 Hz i vågne mus. Denne metode giver os mulighed for at opnå stabil billeddannelse hos vågne mus ved en højere billedhastighed (maksimalt 30 Hz med pixelrammestørrelsen på 512 x 512 pixels) og giver en mere gunstig måde at undersøge overvågningsadfærden hos microglia eller deres interaktion med neuronal aktivitet hos vågne mus.
Vi beskriver protokollen for AAV-injektion og kraniotomi til samtidig billeddannelse af mikroglial dynamik og neuronal aktivitet hos vågne mus samt databehandling. Denne teknik kan afdække koordineringen mellem mikroglial dynamik og neuronal aktivitet på tidsskalaer fra sub-sekund til titusinder af sekunder.
Operationsprotokollen involverer flere teknisk krævende trin. AAV-injektion er et af de kritiske trin. Mislykket AAV-injektion kan medføre en signifikant reduktion i ekspressionen af R-CaMP. Der er to hovedårsager: tilstoppede glaspipetter og vævsskade. Tilstopning af glaspipetter reducerer eller blokerer fuldstændigt udslyngningen af AAV-opløsning. Denne situation kan undgås ved at farve AAV-opløsningen med et farvestof som hurtig grøn og visuelt bekræfte injektionens succes. Vævsskade forårsaget af AAV-injektion forhindrer eksogen genekspression nær midten af injektionsstedet. Den skade, der forårsages af AAV-injektion, skyldes sandsynligvis en pludselig stigning i udstrømningen fra spidsen af glaspipetten efter akkumulering af trykket inde i pipetten. Derfor bør udstrømningen af AAV-opløsning fra glaspipetten være konstant under injektionen. Valg af glaspipetter med en lidt bredere diameter ved deres spidser ville løse dette problem. Ved kranial vinduesimplantation er operationshastigheden kritisk. Hvis operationen tager for lang tid, kan hjernevævet blive alvorligt beskadiget. Derfor er gentagen praksis nødvendig for at sikre operationens hastighed og glathed. Derudover kan kvaliteten af billeddannelsen i løbet af de 4 uger fra operation til billeddannelse reduceres ved vævsregenerering mellem kranievinduet og hjernevævet ved den konventionelle metode17. Metoden her overvinder dette problem ved at anvende tykke briller til kranievinduernes indre glasskive for at hæmme vævsregenerering og holde vinduet klart. I det her beskrevne system var denne effekt tydelig ved anvendelse af en indre glasskive med en tykkelse på 0,525 ± 0,075 μm.
Metoden kan anvendes med succes på mus ældre end 4 uger, men applikationen til yngre mus kan være problematisk. Hos unge mus viser kraniet hurtig og fremtrædende vækst, hvilket fremkalder en uoverensstemmelse mellem kraniebenet og glasvinduet.
I nogle banebrydende undersøgelser blev in vivo to-fotonbilleddannelse brugt til at studere mikroglia-neuroninteraktioner 12,21,23. Især i pionerarbejdet af Merlini et al. udførte de samtidig in vivo-billeddannelse af mikroglial dynamik og neural aktivitet i cellelegemerne21. I denne metode kunne vi ved at bruge tykkere indre briller til kranievinduer undertrykke bevægelsesartefakter i dybdeorienteringen og opnå stabil måling af neuronal aktivitet i mikrostrukturer, såsom dendritiske rygsøjler. Denne metode vil hjælpe med at undersøge synapse-mikrogliale procesinteraktioner i vågne mus.
For nylig viste in vitro-undersøgelse , at tynde filopodia-lignende mikrogliale processer har hurtigere bevægelighed end tykke processer, hvilket tyder på vigtigheden af deres hurtigere bevægelighed i overvågning19. Systemet her kan spore motiliteten af tynde mikrogliale processer med en tidsmæssig opløsning fra et subsekund til et par titalls sekunder. Denne egenskab hjælper med at belyse den funktionelle betydning af deres bevægelighed for overvågning in vivo.
I fremtiden vil kombinationen af denne billeddannelsesteknik med interventioner, såsom optogenetik24 eller kemogenetik25, anvendt på lokale neurale kredsløb eller interregionale neurale forbindelser kaste lys over nye mikrogliale funktioner i synaptisk udvikling og plasticitet, som skulpturerer karakteristika ved neurale kredsløb. Yderligere integration af billeddannelse, intervention og adfærdsmæssige opgaver vil også bidrage til at afsløre koordineringen af mikroglia og neuroner, der ligger til grund for specifik adfærd.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Masashi Kondo og Dr. Masanori Matsuzaki for at levere virusvektorer. Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til S.O.), Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til S.O. og JP19dm0207082 til H.M.), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 til H.M.), Brain Science Foundation (til H. M.).
10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
27G needle | Terumo | NN-2719S | |
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
Isoflurane | Pfizer | N/A | |
Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
Microinjector | KD scienfitic | KDS-100 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
Shading device | Customized | N/A | |
Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Treadmill | Customized | N/A | |
UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |