جمع بيانات Cryo-EM أحادية الجسيمات مع إمالة المرحلة باستخدام Leginon
Summary
يصف هذا البروتوكول مخططا معمما وسهل التنفيذ لجمع بيانات الجسيمات المفردة المائلة في تجارب cryo-EM. مثل هذا الإجراء مفيد بشكل خاص للحصول على خريطة EM عالية الجودة للعينات التي تعاني من تحيز التوجه التفضيلي بسبب الالتزام بواجهة الهواء والماء.
Abstract
يعد تحليل الجسيمات المفردة (SPA) بواسطة المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) الآن تقنية سائدة للبيولوجيا الهيكلية عالية الدقة. يعتمد تحديد الهيكل بواسطة SPA على الحصول على مناظر مميزة متعددة لجسم جزيئي كبير مزجج داخل طبقة رقيقة من الجليد. من الناحية المثالية ، فإن مجموعة من اتجاهات الإسقاط العشوائي الموزعة بشكل موحد ستصل إلى جميع المشاهدات الممكنة للكائن ، مما يؤدي إلى عمليات إعادة بناء تتميز بدقة اتجاهية متباينة الخواص. ومع ذلك ، في الواقع ، تعاني العديد من العينات من جزيئات ذات توجه تفضيلي تلتصق بواجهة الهواء والماء. وهذا يؤدي إلى توزيعات اتجاه زاوي غير منتظمة في مجموعة البيانات وأخذ عينات غير متجانسة من فضاء فورييه في إعادة البناء ، مما يترجم إلى خرائط تتميز بدقة متباينة الخواص. يوفر إمالة مرحلة العينة حلا قابلا للتعميم للتغلب على تباين الخواص بفضل تحسين توحيد توزيعات الاتجاه ، وبالتالي الخواص لأخذ عينات فورييه من الفضاء. يصف هذا البروتوكول استراتيجية مؤتمتة لجمع البيانات ذات مرحلة مائلة باستخدام Leginon ، وهو برنامج للحصول على الصور تلقائيا. الإجراء سهل التنفيذ ، ولا يتطلب أي معدات أو برامج إضافية ، ومتوافق مع معظم المجاهر الإلكترونية القياسية (TEMs) المستخدمة لتصوير الجزيئات البيولوجية الكبيرة.
Introduction
أدى ظهور كاشفات الإلكترون المباشرة على مدار العقد الماضي1،2،3 إلى زيادة هائلة في عدد الهياكل عالية الدقة للجزيئات الكبيرة والتجمعات الجزيئية الكبيرة التي تم حلها باستخدام cryo-EM أحادي الجسيم4،5،6. من المتوقع أن تكون جميع الأنواع الجزيئية المنقاة تقريبا قابلة لتحديد الهيكل باستخدام cryo-EM ، باستثناء أصغر البروتينات ~ 10 كيلو دالتون في الحجم أو أقل من7. كمية المواد الأولية اللازمة لإعداد الشبكة وتحديد الهيكل هي على الأقل ترتيب من حيث الحجم أقل من تقنيات تحديد البنية الأخرى ، مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية4،5،6.
ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي لتحديد الهيكل بواسطة cryo-EM ينطوي على إعداد شبكة مناسبة للتصوير. اقترحت دراسة مستفيضة لتقييم عينات متنوعة باستخدام استراتيجيات وشبكات تزجيج مختلفة أن معظم طرق تزجيج العينات على شبكات cryo-EM تؤدي إلى الالتزام التفضيلي للجزيئات الكبيرة بواجهة الهواء والماء8. ويمكن أن يتسبب هذا الالتزام في أربع نتائج دون المستوى الأمثل: (1) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) أن العينة الجزيئية الكبيرة تتشوه تماما، وفي هذه الحالة لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح؛ و (2) لا يمكن جمع البيانات ومعالجتها بنجاح. (2) تتشوه العينة جزئيا ، وفي هذه الحالة قد يكون من الممكن الحصول على رؤى هيكلية من مناطق الجزيء الكبيرة غير التالفة ؛ (3) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ولكن يتم تمثيل مجموعة واحدة فقط من اتجاهات الجسيمات بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور ؛ (4) تحتفظ العينة بالبنية الأصلية ، ويتم تمثيل بعض وليس كل اتجاهات الجسيمات الممكنة بالنسبة لاتجاه حزمة الإلكترون في الصور. بالنسبة للحالتين (3) و (4) ، سيساعد جمع البيانات المائل في تقليل تباين الخواص في دقة الاتجاه الذي يؤثر على خريطة cryo-EM المعاد بناؤها ويوفر حلا قابلا للتعميم لمجموعة متنوعة من العينات9. من الناحية الفنية ، يمكن أن يفيد الإمالة أيضا الحالة (2) ، حيث يفترض أن يحدث التمسخ عند السطح البيني بين الهواء والماء ويحد بالمثل من عدد الاتجاهات المميزة الممثلة في البيانات. يمكن تغيير مدى تحيز التوجه في مجموعة البيانات من خلال تجربة إضافات الحلول ، لكن الافتقار إلى قابلية التطبيق الواسعة يعيق مناهج التجربة والخطأ هذه. يكفي إمالة مرحلة العينة بزاوية إمالة محسنة واحدة لتحسين توزيع الاتجاهات بحكم تغيير هندسة تجربة التصوير9 (الشكل 1). نظرا للتكوين الهندسي للعينة ذات التوجه التفضيلي فيما يتعلق بحزمة الإلكترون ، لكل مجموعة من الاتجاهات التفضيلية ، فإن إمالة الشبكة تولد مخروطا من زوايا الإضاءة فيما يتعلق بالسنترويد العنقودي. ومن ثم ، فإن هذا ينشر وجهات النظر وبالتالي يحسن أخذ عينات فضاء فورييه والخواص الخواص في دقة الاتجاه.
هناك ، في الممارسة العملية ، بعض الأضرار لإمالة المسرح. يؤدي إمالة مرحلة العينة إلى إدخال تدرج تركيز عبر مجال الرؤية ، مما قد يؤثر على دقة تقديرات وظيفة نقل التباين (CTF). قد يؤدي جمع البيانات المائل أيضا إلى زيادة حركة الجسيمات التي يسببها الحزمة بسبب زيادة تأثيرات الشحن عند تصوير العينات المائلة. يؤدي إمالة الشبكة أيضا إلى زيادة سمك الجليد الظاهري ، مما يؤدي بدوره إلى صور مجهرية أكثر ضوضاء وقد يؤثر في النهاية على دقة عمليات إعادة البناء5،9،10. وقد يكون من الممكن التغلب على هذه المسائل بتطبيق مخططات متقدمة لمعالجة البيانات الحاسوبية يرد وصفها بإيجاز في قسمي البروتوكول والمناقشة. أخيرا ، يمكن أن يؤدي الإمالة إلى زيادة تداخل الجسيمات ، مما يعيق خط أنابيب معالجة الصور اللاحق. على الرغم من أنه يمكن التخفيف من ذلك إلى حد ما عن طريق تحسين تركيز الجسيمات على الشبكة ، إلا أنه مع ذلك اعتبار مهم. هنا ، يتم وصف بروتوكول سهل التنفيذ لجمع البيانات المائلة باستخدام مجموعة برامج Leginon (برنامج آلي للحصول على الصور) ، متاح للوصول المفتوح ومتوافق مع مجموعة واسعة من المجاهر11،12،13،14. تتطلب الطريقة الإصدار 3.0 على الأقل أو أعلى ، مع الإصدارات 3.3 وما بعده التي تحتوي على تحسينات مخصصة لتمكين جمع البيانات المائلة. لا توجد برامج أو معدات إضافية ضرورية لهذا البروتوكول. يتم توفير تعليمات شاملة حول البنية التحتية الحاسوبية وأدلة التثبيت في مكان آخر15.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد اتجاه الجسيمات المفضل الناجم عن التصاق العينة بواجهة الهواء والماء أحد آخر الاختناقات الرئيسية لتحديد الهيكل الروتيني عالي الدقة باستخدام cryo-EM SPA4،5،6. يوفر مخطط جمع البيانات المعروض هنا استراتيجية سهلة التنفيذ لتحسين توزيع اتجاه ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بيل أندرسون وتشارلز بومان وجان كريستوف دوكوم (TSRI) للمساعدة في الفحص المجهري وتركيبات Leginon والبنية التحتية لنقل البيانات. كما نشكر غوردون لوي (معهد سالك) ويونغ زي تان (جامعة سنغافورة الوطنية) على القراءة النقدية للمخطوطة. نشكر كريس روسو (مختبر MRC للبيولوجيا الجزيئية ، كامبريدج) لتزويدنا بالبلازميد للتعبير عن DPS. تم دعم هذا العمل بمنح من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة (U54AI150472 و U54 AI170855 و R01AI136680 إلى DL) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF MCB-2048095 إلى DL) ، ومؤسسات هيرست (إلى DL) ، وكرسي آرثر وجولي وودرو (إلى JP N.).
Materials
| Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
| DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
| K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
| Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
| Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
| Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
| UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
References
- Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
- Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461 (2013).
- Li, X. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
- Chua, E. Y. D., et al. cheaper: recent advances in cryo-electron microscopy. Annual Review of Biochemistry. , (2022).
- Lyumkis, D. Challenges and opportunities in cryo-EM single-particle analysis. Journal of Biological Chemistry. 294 (13), 5181-5197 (2019).
- Wu, M., Lander, G. C. Present and emerging methodologies in Cryo-EM single-particle analysis. Biophysical Journal. 119 (7), 1281-1289 (2020).
- Henderson, R. The potential and limitations of neutrons, electrons and X-rays for atomic resolution microscopy of unstained biological molecules. Quarterly Reviews of Biophysics. 28 (2), 171-193 (1995).
- Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. Elife. 7, 34257 (2018).
- Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nature Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Potter, C. S., et al. Leginon: a system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
- Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
- Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Science. 30 (1), 136-150 (2021).
- Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
- . NYSBC.org Homepage Available from: https://emg.nysbc.org/redmine/projects/leginon/wiki/Leginon_Homepage (2022)
- Russo, C. J., Passmore, L. A. Electron microscopy: Ultrastable gold substrates for electron cryomicroscopy. Science. 346, 1377-1380 (2014).
- Russo, C. J., Henderson, R. Charge accumulation in electron cryomicroscopy. Ultramicroscopy. 187, 43-49 (2018).
- Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (180), e62765 (2022).
- Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
- Naydenova, K., Peet Mathew, J., Russo Christopher J, J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (24), 11718-11724 (2019).
- Naydenova, K., et al. CryoEM at 100 keV: a demonstration and prospects. IUCrJ. 6 (6), 1086-1098 (2019).
- Herzik, M. A., Gonen, T., Nannenga, B. L. . cryoEM: Methods and Protocols. , 125-144 (2021).
- Cash, J. N., Kearns, S., Li, Y., Cianfrocco, M. A. High-resolution cryo-EM using beam-image shift at 200 keV. IUCrJ. 7 (6), 1179-1187 (2020).
- Peck, J. V., Fay, J. F., Strauss, J. D. High-speed high-resolution data collection on a 200 keV cryo-TEM. IUCrJ. 9 (2), 243-252 (2022).
- Bouvette, J., et al. Beam image-shift accelerated data acquisition for near-atomic resolution single-particle cryo-electron tomography. Nature Communications. 12 (1), 1957 (1957).
- Cheng, A., et al. High resolution single particle cryo-electron microscopy using beam-image shift. Journal of Structural Biology. 204 (2), 270-275 (2018).
- Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nature Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
- . Structura Biotechnology Inc Available from: https://cryosparc.com/live (2022)
- DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion. Journal of Visualized Experiments. (179), e63387 (2022).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Non-uniformity of projection distributions attenuates resolution in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 150, 160-183 (2020).
- Baldwin, P. R., Lyumkis, D. Tools for visualizing and analyzing Fourier space sampling in Cryo-EM. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 160, 53-65 (2021).
- Aiyer, S., Zhang, C., Baldwin, P. R., Lyumkis, D., Gonen, T., Nannenga, B. L. . cryoEM: Methods and Protocols. , 161-187 (2021).
- Glaeser, R. M., et al. Defocus-dependent Thon-ring fading). Ultramicroscopy. 222, 113213 (2021).
