本方案描述了一种蜱胚胎显微注射的方法。胚胎注射是进行遗传操作以建立转基因品系的首选技术。
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本文内容
摘要
摘要
蜱虫可传播多种病毒、细菌和原生动物病原体，因此被视为具有重要医学和兽医意义的传播媒介。尽管蜱传疾病的负担日益加重，但由于蜱虫独特的生物学特性使得遗传转化工具在功能研究中的应用面临挑战，导致蜱虫相关研究落后于昆虫病媒。近年来，遗传干预手段在控制蚊媒疾病方面受到越来越多关注。然而，此类干预措施的开发需要通过胚胎显微注射实现稳定的种系转化。但包括蜱虫在内的螯肢动物至今缺乏相应的胚胎注射技术。蜱虫胚胎外部具有较厚的蜡质层、坚硬的卵壳以及较高的卵内压力等因素，是此前阻碍蜱虫胚胎注射方案建立的主要障碍 。本研究已克服上述难题，本文描述了一种针对黑腿蜱 Ixodes scapularis 的胚胎注射技术 。该技术可用于递送CRISPR/Cas9等成分，实现稳定的种系遗传转化。
引言
蜱是具有重要医学和兽医意义的传播媒介，能够传播多种病毒、细菌、原生动物病原体以及线虫1,2。在美国东部，黑腿蜱（Ixodes scapularis）是莱姆病（LD）病原体——螺旋体Borrelia burgdorferi的重要传播媒介。美国每年报告超过40万例莱姆病病例，使其成为美国最主要的虫媒传染病1。除B. burgdorferi外，I. scapularis还可传播另外六种微生物，包括四种细菌（Anaplasma phagocytophilum、B. mayonii、B. miyamotoi和Ehrlichia muris eauclarensis）、一种原生动物寄生虫（Babesia microti）以及一种病毒（Powassan病毒），因此该蜱种已成为重大的公共卫生问题3。尽管近年来蜱传疾病日益普遍，但由于蜱独特的生物学特性以及在应用遗传学和功能基因组学工具方面所面临的挑战，蜱类研究仍落后于其他节肢动物媒介（如蚊子） 4,
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方案
Ixodes scapularis 成虫购自俄克拉荷马州立大学（Oklahoma State University, OSU）或在内华达大学雷诺分校（University of Nevada, Reno, UNR）（IACUC 方案编号 #21-001-1118）饲养。
1. 胚胎采集用雌性蜱虫的准备
注意：为了收集合适年龄的卵，必须同步产卵时间。尽管蜱虫产卵的诱导信号尚不明确，但在标准的昆虫饲养条件下（27 °C 温度和>90% 相对湿度（RH）），I. scapularis 雌虫通常在脱离宿主后约8天开始产卵。通过将吸饱血的雌虫储存在4 °C条件下，可延长该时间线。我们将吸血后的雌虫在4 °C下储存长达8周，对产卵未产生任何不利影响。这些条件可能需要根据每个昆虫饲养室的具体情况进行调整。
- 将所有成熟的雌性个体在 4 °C 下保存 >在衬有湿润滤纸的6夸脱塑料盒中，于90%相对湿度条件下保存，直至用于显微注射。
- 注射前一周，将雌虫从 4 °C 转移至 27 °C 培养箱，以启动产卵。
- 当雌虫开始产卵（移至 27 °C 后 3–4 天），使用细头画笔清除所有卵，并准备对雌虫进行吉内氏器官（蜡腺）切除。
注意：Gene 器官从盾板与头胸部之间（口器背基部）延伸而....
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结果
本文介绍了一种成功的I. scapularis胚胎显微注射方案。产卵雌蜱被置于高湿度环境中，以防止部分蜡化的卵发生脱水。通过消融怀卵雌蜱的Gene器官（蜡腺），去除卵表面的蜡层，从而实现对蜱胚胎的显微注射（图1A-E）。我们使用了颈部较短的铝硅酸盐玻璃针（图2），这种针型更适合蜱卵注射，因其耐压性能优于用于昆虫卵注射的长颈（锥形）玻璃针。由于蜱卵呈球形，需在载玻片下方设置平台（图3A），以防止注射针插入过程中卵滚动脱落。目前对I. scapularis早期胚胎发育过程尚不清楚，因此生殖细胞形成的时间和位置也未知。为此，我们选择在胚胎发育早期（12–18小时龄）进行注射，并发现将卵的长轴垂直于载玻片边缘摆放时，卵的存活率更高（图3B、C）。采用本方案，已对数千枚卵进行.......
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讨论
这是首个成功注射早期蜱类胚胎的实验方案。已实现约4%-8%的存活率，与其他成熟的昆虫模式生物的胚胎注射存活率相当5。
由于这是首个实验方案，预计该方案将针对不同蜱虫物种进一步优化和特化。特别是注射时机将因物种而异，取决于胚胎发育过程，尤其是细胞化发生的时间。初步数据显示，I. scapularis 虫卵在产卵后的最初24小时内不会经历快速的核分裂，细胞化发生在数天之后（未发表数据）。我们已利用本方案成功实现了质粒递送4、CRISPR介导的基因敲除4以及细菌（Wolbachia）的递送（表1）。预计该胚胎注射方案将为创建转基因蜱虫提供可能，并使任何实验室都能开展基因敲除和敲入研究。这将有助于加快对蜱虫生物学及蜱虫-病原体-宿主相互作用的研究进程。
实验方案中的关键步骤
必须在产卵后24小时内.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢马里兰大学ITF的Channa Aluvihare和Yonus Gebermicale在方案开发初期提供的指导与支持。钨针由马里兰大学ITF的David O'Brochta慷慨赠送。我们感谢Ladislav Simo博士在I. ricinus中测试本方案以及富有见地的讨论。本项目由NIH-NIAID R21AI128393和纽约Plymouth Hill基金会资助给MG-N，内华达大学向AN提供的启动资金，美国国家科学基金会资助号2019609（资助MG-N和AN），以及IGTRCN向AS提供的同行资助项目（Peer-to-Peer Grant）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带细丝的硅酸铝毛细管 | Sutter instruments | AF100-64-10 | 胚胎注射 |
| 水中50%苯扎氯铵，25 g | TCI-America | B0414 | 胚胎处理，25 g约等于25 mL |
| 滤纸 | Whatman | 1001-090 | 注射后护理 |
| 镊子 | Thomas Scientific | 300-101 | 基因器官操作 |
| 实验室擦拭纸 | Genesee Scientific | 88-115 | |
| 微量加样头 | Eppendorf | 930001007 | 用于装填拉制好的针头 |
| 显微操作仪 | Sutter instruments | ROE-200 | 胚胎注射 |
| 载玻片-普通，磨边 | Genesee Scientific | 29-100 | 胚胎排列，推荐使用磨边载玻片，斜边可能遮挡卵的视野 |
| 氯化钠（NaCl） | Research Products International | S23020-500.0 | 胚胎处理 |
| 针头拉制仪 | Sutter Instruments | P-1000 | |
| 永久双面胶带 | Scotch | 34-8716-3417-5 | 胚胎排列 |
| 培养皿 | Genesee Scientific | 32-107G | 注射后护理 |
| Tegaderm/透明薄膜敷料 | 3M Healthcare | 1628 | 胚胎排列 |
| 钨针 | Fine Science Tools | 10130-10 | 基因器官操作 |
| 钨丝 | Amazon | B08DNT7ZK3 | 基因器官操作 |
| XenoWorks 数字显微注射仪 | Sutter instruments | MPC-200 | 胚胎注射 |
参考文献
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection....
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重印与许可
