Le présent protocole décrit une méthode d’injection d’embryons de tiques. L’injection d’embryons est la technique préférée de manipulation génétique pour générer des lignées transgéniques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Technique d’injection d’embryons pour l’édition de gènes chez la tique à pattes noires, Ixodes scapularis
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les tiques peuvent transmettre divers agents pathogènes viraux, bactériens et protozoaires et sont donc considérées comme des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire. Malgré le fardeau croissant des maladies transmises par les tiques, la recherche sur les tiques a pris du retard par rapport aux insectes vecteurs de maladies en raison des défis liés à l’application des outils de transformation génétique pour les études fonctionnelles à la biologie unique des tiques. Les interventions génétiques ont attiré l’attention pour réduire les maladies transmises par les moustiques. Cependant, le développement de telles interventions nécessite une transformation germinale stable par injection d’embryons. Une telle technique d’injection d’embryons fait défaut pour les chélicérates, y compris les tiques. Plusieurs facteurs, tels qu’une épaisse couche de cire externe sur les embryons de tiques, un chorion dur et une pression intra-ovale élevée, sont des obstacles qui empêchaient auparavant le développement du protocole d’injection d’embryons chez les tiques. Le présent travail a surmonté ces obstacles, et une technique d’injection d’embryons pour la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est décrite ici. Cette technique peut être utilisée pour fournir des composants, tels que CRISPR / Cas9, pour des transformations germinales stables.
Introduction
Les tiques sont des vecteurs d’importance médicale et vétérinaire, capables de transmettre une variété d’agents pathogènes viraux, bactériens, protozoaires et nématodes 1,2. Dans l’est des États-Unis, la tique à pattes noires, Ixodes scapularis, est un vecteur important de l’agent pathogène de la maladie de Lyme (ML), le spirochète Borrelia burgdorferi. Plus de 400 000 cas de ML sont signalés chaque année aux États-Unis, ce qui en fait la principale maladie infectieuse à transmission vectorielle aux États-Unis1. En plus de B. burgdorferi, six autres microorgan....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Les adultes d’Ixodes scapularis ont été achetés à l’Université d’État de l’Oklahoma (OSU) ou élevés à l’Université du Nevada, Reno (UNR) (protocole IACUC #21-001-1118).
1. Préparation des tiques femelles pour la collecte d’embryons
REMARQUE: Pour collecter des œufs d’âge approprié, il est important de synchroniser la ponte. Bien que les indices de ponte chez les tiques restent incertains, dans les conditions insectaires standard (température de 27 °C et humidité relative (HR) de >90 %), les femelles d’I. scapularis commencent à pondre environ 8 jours après le détachement de l’hôte....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Un protocole d’injection embryonnaire efficace pour I. scapularis est décrit dans cet article. Les femelles pondeuses ont été maintenues à une humidité élevée pour éviter la dessiccation des œufs partiellement cirés. La couche de cire a été retirée pour injecter des embryons de tiques en ablant l’organe du gène (glande de cire) de la femelle gravide (Figure 1A-E). Nous avons utilisé des aiguilles en verre aluminosilicate avec un col plus court (
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Il s’agit du premier protocole développé pour injecter avec succès des embryons précoces de tiques. Un taux de survie de ~4%-8% a été atteint, ce qui est comparable à l’injection d’embryons dans d’autres modèles d’insectes bien établis5.
Comme il s’agit du protocole initial, on s’attend à ce que ce protocole soit affiné et spécialisé pour chaque espèce de tique. En particulier, le moment de l’injection variera d’une espèce à l’autre, en fonction de l’embryogenèse, en pa.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Channa Aluvihare et Yonus Gebermicale, ITF, UMD, pour leur perspicacité et leur soutien au cours de la phase initiale de développement du protocole. Les aiguilles en tungstène ont été généreusement offertes par David O’Brochta, ITF, UMD. Nous remercions le Dr Ladislav Simo d’avoir testé ce protocole dans I. ricinus et d’avoir eu des discussions perspicaces. Ce projet a été financé par NIH-NIAID R21AI128393 et Plymouth Hill Foundation, NY à MG-N, des fonds de démarrage de l’Université du Nevada à AN, la subvention n ° 2019609 de la National Science Foundation à MG-N et AN, et une subvention entre pairs de l’IGTRCN à AS.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Capillaires en silicate d’aluminium, avec filament | Instruments Sutter | AF100-64-10 | Injection d’embryons |
| Chlorure de benzalkonium 50 % dans l’eau, 25 g | TCI-America | B0414 | Traitement d’embryons, 25 g correspondent à environ 25 mL |
| Papier filtre | Whatman | 1001-090 | Soins post-injection |
| Pince | Thomas Scientific | 300-101 | Organe du gène manipulation |
| Lingettes de laboratoire | Genesee Scientific | 88-115 | |
| Embouts de microchargeur | Eppendorf | 930001007 | Chargement des aiguilles tirées |
| Micromanipulateur | Instruments de Sutter | ROE-200 | Injection d’embryons |
| Lames microscopiques - lisses, bords rectifiés | Genesee Scientific | 29-100 | Alignement de l’embryon, les bords rectifiés sont préférés, les bords biseautés pourraient Cacher les œufs à la vue |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 | Traitement |
| l’embryon Extracteur d’aiguille | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Permanent Ruban adhésif double face | Scotch | 34-8716-3417-5 | Alignement de l’embryon |
| Plaques de Pétri | Genesee Scientific | 32-107G | Soin post-injection |
| Tegaderm/ Transparent pansement filmique | 3M Healthcare | 1628 | Alignement |
| d’embryons Aiguilles en tungstène | Outils de science fine | 10130-10 | Manipulation d’organes de gènes |
| Fil de tungstène | Amazon | B08DNT7ZK3 | Manipulation d’organes |
| de gènes Micro-injecteur numérique XenoWorks Instruments | mesure | MPC-200 | Injection d’embryons |
Références
- Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).
- Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).
- Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).
- Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
