Insamling och långsiktigt underhåll av bladskärande myror (Atta) under laboratorieförhållanden

Summary

Här beskrivs ett protokoll för att framgångsrikt samla in och upprätthålla friska Atta (Hymenoptera: Formicidae) myrkolonier under laboratorieförhållanden. Dessutom beskrivs olika nesttyper och konfigurationer tillsammans med möjliga experimentella procedurer.

Abstract

Myror är en av de mest biologiska mångfaldsgrupperna av djur på planeten och bor i olika miljöer. Underhållet av myrkolonier i kontrollerade miljöer möjliggör en berikad förståelse av deras biologi som kan bidra till tillämpad forskning. Denna praxis används vanligtvis i populationskontrollstudier av arter som orsakar ekonomisk förlust, såsom Atta-myror . För att odla sin mutualistiska svamp samlar dessa bladskärande myror löv och för detta betraktas som jordbruksskadedjur som är utbredda över hela den amerikanska kontinenten. De är mycket socialt organiserade och bor i utarbetade underjordiska bon som består av en mängd olika kamrar. Deras underhåll i en kontrollerad miljö beror på en daglig rutin med flera procedurer och frekvent vård som beskrivs här. Det börjar med samlingen av drottningar under reproduktionssäsongen (dvs bröllopsflygning), som sedan överförs individuellt till plastbehållare. På grund av den höga dödligheten hos drottningar kan en andra samling utföras cirka 6 månader efter bröllopsflygningen, när begynnande bon med utvecklad svampvadd grävs ut, handplockas och placeras i plastbehållare. I laboratoriet tillhandahålls löv dagligen till etablerade kolonier, och myrproducerat avfall avlägsnas varje vecka tillsammans med återstående torrt växtmaterial. När svampträdgården fortsätter att växa överförs kolonier till olika typer av behållare enligt experimentsyftet. Bladskärande myrkolonier placeras i sammankopplade behållare, som representerar organisationssystemet med funktionella kamrar byggda av dessa insekter i naturen. Denna inställning är idealisk för att övervaka faktorer som avfallsmängd, svampträdgårdshälsa och arbetarnas och drottningens beteende. Underlättad datainsamling och mer detaljerade observationer anses vara den största fördelen med att hålla myrkolonier under kontrollerade förhållanden.

Introduction

Myror utgör en mångsidig grupp individer som påverkar de flesta markmiljöer¹. De fungerar som effektiva spridare ^2,3,4, rovdjur⁵ och ekosystemingenjörer ^6,7,8,9,10, vilket belyser deras betydelse och ekologiska framgång på naturliga ekosystem. Alla myrarter klassificeras som eusociala insekter; deras sociala organisation varierar dock mycket mellan olika artgrupper, dvs. arbetsdelningssystem, funktionella grupper, kommunikation mellan individer, foderorganisation, kolonifundament och reproduktionsprocess¹¹. Som en mycket diversifierad grupp tillgriper de flera matresurser och specialiserade utfodringsbeteenden. Faktum är att jordbruket inte bara var ett stort steg för den mänskliga civilisationen utan också för myrarter. Cirka 55 till 65 Ma sedan¹² började attinmyror odla svampar och införliva dem i en nästan exklusiv diet. De blev så specialiserade att de utvecklade strikta, beroende och obligatoriska interaktioner klassificerade som symbios, där en individ inte överlever utan den andra.

Lägre svampväxande myror samlar och bearbetar dött organiskt material, såsom fragment av ruttnande blad, för att odla sin mutualistiska svamp; medan högre svampväxande myror skördar färskt växtmaterial och komponerar ett av de mest framgångsrika symbiotiska naturliga systemen¹³. Denna högspecialiserade jordbruksteknik gjorde det möjligt för dem att gripa en ny nisch. De högre attinmyrorna består av bladskärande myror, en monofyletisk grupp som väcker mellan 19 Ma (15-24 Ma) och 18 Ma (14-22 Ma)^14,15,16 bestående av fyra giltiga släkten: Atta Fabricius, Acromyrmex Mayr^, Amoimyrmex Cristiano och Pseudoatta Gallardo. Bladskärarjordbrukssystemet som utfördes av bladskärande myror, utvecklades från härledda jordbrukssystem¹⁷. De flesta av dessa arter utnyttjar uteslutande den mutualistiska svamparten Leucoagaricus gongylophorus Singer¹⁸ (även kallad Leucocoprinus gongylophorus Heim¹⁹), vilket markerar en betydande evolutionär övergång¹¹. Svampsorterna överförs vertikalt, från ursprungliga bon till avkommor, vilket tyder på att de är klonalt förökade²⁰.

Anmärkningsvärt utvecklade Atta-samhällen en komplex organisationsstruktur av enorm betydelse i sin miljö och av stort intresse för myrmekologer. Deras befolkning kan bestå av miljontals individer, de flesta av dem sterila kvinnliga arbetare som uppvisar en accentuerad polymorfism, dvs distinkt storlek och anatomisk morfologi. Befolkningen kännetecknas av kaster beroende på ålder, fysiologiskt tillstånd, morfologisk typ, beteenden och specialiserade aktiviteter i kolonin²¹. Arbetare kan diskrimineras till trädgårdsmästare och sjuksköterskor, generalister inom boet, födosökare och grävmaskiner och försvarare eller soldater²¹. Denna organisation möjliggör utförandet av uppgifter i samarbete och ett självorganiserande system som kan producera mycket strukturerade kollektiva beteenden, så att de kan reagera effektivt på miljöstörningar²².

Befolkningsförnyelsens roll spelas av en enda drottning (dvs. monogyn), så länge hon lever, som utgör den permanenta reproduktiva kasten²². Atta drottningar är kända för att leva i mer än 20 år och lägger ägg under hela sin livslängd²³. Eftersom drottningen är oersättlig är dess uthållighet avgörande för kolonins överlevnad ^13,20,23,24. Ändå kan tusentals bevingade reproduktiva honor och män hittas i boet under häckningssäsonger, men ingen stannar i det ursprungliga boet och bildar en tillfällig kast²². I Atta sexdens kolonier produceras nästan 3 000 reproduktiva honor och 14 000 reproduktiva hanar²⁵. Det inträffar när en koloni når sexuell mognad, cirka 38 månader från dess genomförande, och upprepas årligen sedan dess tills den släcks^23,25. Nya Attakolonier etableras genom haplometros, där en drottning påbörjar ett nytt bo.

När miljöförhållandena är gynnsamma lämnar reproducenterna det underjordiska boet för att börja bröllopsflygningen. Perioden för dess förekomst skiljer sig från region, som sträcker sig längs året över hela det brasilianska territoriet beroende på arten. Händelsen verkar dock föregås av regn och fukthöjning²⁶, vilket kan relateras till utgrävningsunderlättande på grund av markfuktighet²². Ofta, 1-5 veckor före bröllopsflygningen, breddas boingångar och kanaler för att underlätta för de reproduktiva individerna att avgå. Innan de lämnar sina moderkolonier samlar de bevingade kvinnorna och lagrar, i ett infrabuccalt hålrum, en del av den mutualistiska svampen^20,27. Flera kopulationer utförs mitt i flygningen, och det beräknas att en drottning kan insemineras av tre till åtta män (dvs. polyandri) hos vissa arter²⁸, vilket säkerställer genetisk variation²⁹. Därefter fortsätter drottningarna till jorden och föredrar platser med ingen eller få vegetation²⁵, där de tar bort sina vingar och gräver ut sin första bokammare. Detta är den enda perioden där drottningar kan ses utanför boet. Även om individer i den tillfälliga kasten sågs i konstgjorda bon, är det okänt om någon framgångsrik kopulation (dvs. bröllopsflygning) utfördes under laboratorieförhållanden²⁴.

Den ursprungliga bokonstruktionen motsvarar kolonins mest avgörande period, som kan variera från 6 h till 8 h^23,25. För närvarande kloster drottningen sig i den första kammaren, och om några dagar börjar ovipositionen. De första äggen matas till mycelialen som drottningen regurgitates, vilket markerar början på kolonins svampträdgård. De första larverna uppträder på cirka 25 dagar²², och nästan i slutet av den första månaden består kolonin av en matta av prolifererande svamp, där omogna (ägg, larver och puppar) är kapslade och drottningen, som höjer sin första avkomma isolerat²³. Ägg är också matresursen för de första larverna och konsumeras mycket av drottningen¹³. Dessutom försörjer sig drottningen med fettkroppsreserver och kataboliserande vingmuskler som inte längre är till nytta¹³. Den ursprungliga svampkulturen konsumeras inte eftersom koloniöverlevnaden beror på dess utveckling, och under denna period befruktar drottningen den med fekalvätska¹³. Dagar efter uppkomsten öppnar de första arbetarna boets ingång och börjar en födosöksaktivitet i boets närområde¹³. De införlivar materialet som samlats in som substrat för svampträdgården, som nu fungerar som mat för arbetarna^13,22. Innan det läggs till svampkulturen skärs växtmaterialet som bärs in av arbetarna i små bitar och fuktas med fekalvätska¹³. Myrorna manipulerar svampinokulum för att öka och kontrollera dess tillväxt, vilket kommer att tjäna till att dela upp stora jordgrävda kamrar, specialiserade på konditionering av trädgården 13,22,25.

Cirka 6 månader efter bröllopsflygningen innehåller A. sexdens bon en svampkammare och några kanaler. Den stora specialiseringen i byggandet av bladskärande myrbon fungerar som en försvarsmekanism mot naturliga fiender och ogynnsamma miljöfaktorer²². Bladskärande myror är kända för att fragmentera svampträdgården och överföra den till kamrar med hög luftfuktighet när kamrarna börjar torka ut¹³. Således, trots att utgrävningen av boet har en betydande energikostnad, är den investerade energin omvänd i fördelar för kolonin själv²². Med några få undantag gör Atta-arter också specialiserade kamrar för kolonins avfall, mestadels gjorda av utarmat svampsubstrat och kroppar av döda myror, isolerar det från resten av boet och upprättar en viktig social immunitetsstrategi³⁰. Dessutom manipulerar en distinkt grupp arbetare avfallet direkt för att undvika kontaminering av andra individer. Arbetare födosöker ständigt för att vårda svampen, som är kolonins huvudsakliga näringsresurs. De kan dock också mata på växtsaft när de skär fragment. Växtmaterialet är noga utvalt för svampträdgårdens skötsel och påverkas av många faktorer som bladegenskaper och ekosystemets egenskaper¹³.

Födosöksstrategin för bladskärande myror för att få färskt material är mycket komplex och i kombination med den höga skördeefterfrågan hos etablerade kolonier resulterar det i betydande ekonomiska förluster för jordbruksproducenter och äventyrar skogsrestaureringsområden^22,31. Därför kan dessa myror kategoriseras som skadedjur i de flesta områden där de kan påträffas, allt från södra USA till nordöstra Argentina 11,13,22,32. Släckningen av problematiska kolonier är utmanande på grund av den serie anpassningar som är inneboende i dessa insekters biologi (dvs. social organisation, födosök, svampodling, hygien och komplexa bostrukturer)³³. Populationsbekämpningsstrategierna skiljer sig därför från dem som vanligtvis tillämpas på andra skadeinsekter och tillgriper främst attraktiva förorenade beteserbjudanden^33,34. Men eftersom dessa myror kan avvisa skadliga ämnen för både svampen och koloniindividerna och kompromissa med odlade fält 33, testas ständigt nya naturliga föreningar och kontrollalternativ^33,35,36. Eftersom experimentresultat knappast kan övervakas på fälttestade kolonier utförs preliminära uppsatser i en kontrollerad miljö.

Således måste experimentella protokoll anpassas till intressegrupper med tanke på myrornas heterogena livsstil, stödja studier på artnivå och redovisa kolonier som operativa enheter, där en myra är ett element i en komplex superorganism¹¹. De rapporter som hittills samlats in om Atta -släktet gjorde det möjligt att framgångsrikt samla in och underhålla kolonier under laboratorieförhållanden och erkänna deras grundläggande behov och allmänna funktion. Baserat på deras naturliga processer som reproduktion, kolonigrundande och utfodringsbeteenden har en rutin av metoder utvecklats som möjliggör långsiktig etablering av kolonier i olika typer av bon. Här beskrivs ett procedurprotokoll för att upprätthålla bladskärande myror i laboratoriet och belyser möjlig allmän forskning med distinkta experimentändamål och vetenskaplig uppsökande verksamhet.

Protocol

1. Samling av drottningar Sök i litteraturen för perioden av Atta reproduktionssäsong i regionen av intresse. Förekomsten av reproduktionssäsong, frekvensen och dagtid för bröllopsflygningar varierar beroende på regionala klimatförhållanden (tabell 1). Även om det vanligtvis äger rum på våren, måste denna information samlas in för den plats där samlingen är avsedd att ske 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46.<sup class="xre…

Representative Results

Ett flödesschema som visar processen för myruppsamling visas i figur 6. Här visas några resultat som erhållits med hjälp av protokollet för insamling, underhåll och nestinställningar som beskrivs ovan. Figur 6: Flödesschema för insamling av bladskärande myrors kolonier. Efter pro…

Discussion

Protokollet som beskrivs här för att upprätthålla bladskärande myrkolonier har utvecklats och tillämpats i över tre decennier på ett självsäkert och replikerbart sätt. Det möjliggjorde utvecklingen av forskning som skulle begränsas av fältförhållanden. Därmed blev friska myror och kolonier tillgängliga för forskning inom flera områden som jämförande morfologi, toxikologi 51,52, histologi⁵³ och mikrobiologi^54,55,56<sup…

Materials

Entomologic forceps	N/A	N/A	N/A
Glass tank	N/A	N/A	Tempered glass, custom made
Hose	N/A	N/A	Transparent, PVC 1/2 Inch x 2,0 mm
Latex gloves	Descarpack	550301	N/A
Nitrile gloves	Descarpack	433301	N/A
Open arena	N/A	N/A	Polypropylene crate
Plaster pouder	N/A	N/A	Plaster pouder used in construction, must be absorbant
Plastic Containers for collection	Prafesta	Natural Cód.: 8231/Natural Cód.: 8262	Lidded, transparent , polypropylene
Plastic containers for nests	Prafesta	Discontinued	Polystyrene, hermetic
Teflon	Dupont	N/A	Polytetrafluoroethylene liquid (PTFE Dispertion 30)