Det nuvarande protokollet beskriver de kontrollerade mikrobladsskraporna på ytan av ledbrosket efter destabilisering av musknäet genom att skära det mediala miniscotibialligamentet. Denna djurmodell presenterar en accelererad form av artros (OA) som är lämplig för att studera osteofytbildning, osteoskleros och smärta i tidigt skede.
Artros är den vanligaste muskuloskeletala sjukdomen hos personer över 45 år, vilket leder till en ökande ekonomisk och samhällelig kostnad. Djurmodeller används för att efterlikna många aspekter av sjukdomen. Detta protokoll beskriver destabiliserings- och broskskrapmodellen (DCS) av posttraumatisk artros. Baserat på den allmänt använda destabiliseringen av den mediala meniskmodellen (DMM) introducerar DCS tre repor på brosytan. Den aktuella artikeln belyser stegen för att destabilisera knäet genom att transektera det mediala meniskotibiella ligamentet följt av tre avsiktliga ytliga repor på ledbrosket. De möjliga analysmetoderna genom dynamisk viktbärande, mikrodatortomografi och histologi demonstreras också. Medan DCS-modellen inte rekommenderas för studier som fokuserar på effekten av artros på brosket, möjliggör den studier av artrosutveckling i ett kortare tidsfönster, med särskilt fokus på (1) osteofytbildning, (2) artros- och skadesmärta och (3) effekten av broskskador i hela leden.
Artros (OA) är den vanligaste muskuloskeletala sjukdomen hos personer över 45 år, med över 8,75 miljoner som söker behandling i Storbritannien1. Den ökande förekomsten av sjukdomen har lett till en ökad ekonomisk och samhällelig kostnad, är en stor bidragande orsak till funktionsnedsättning och minskar livskvaliteten för patienter1. Utan tillgängliga behandlingar finns det ett akut behov av att påskynda forskningen för att förstå utvecklingen och utvecklingen av sjukdomen. Sjukdomen är komplex och även multifaktoriell till sin natur. De viktigaste kliniska mätningarna av sjukdomen är smärta och ledrörlighet2, och OA påverkar alla vävnader i leden, inte bara brosk3. En av de största utmaningarna för att förstå OA är att det kan ta år, ibland decennier, från initial presentation/skada till symtomatisk sjukdomsprogression med smärta och orörlighet.
Modellering av artros hos gnagare har förbättrat vår kunskap om OA-patofysiologi genom att låta oss förstå initiering och progression inom en mycket kortare tidsram och med en detaljerad undersökning av de involverade vävnaderna. Det finns många murina modeller av artros, från genetiskt modifierade djur till kirurgiska interventionsmodeller. Den mest använda murina modellen av posttraumatisk OA är destabiliseringen av den mediala menisken (DMM)4,5. En varning för modellen är variationen mellan olika operatörer. Erfarna kirurger kan utföra proceduren med minimal ledskada, medan oerfarna operatörer exponerar ledkapseln under längre perioder och orsakar skador på brosket. Denna variation i processen påverkar modellens svårighetsgrad, med mer initial skada som leder till ökade broskskador och osteofytbildning. I syfte att minska variationen mellan operatörer och efterlikna broskskador från klinisk intervention utvecklas en modifierad version av denna modell, varigenom kontrollerad ytterligare skada på broskytan i form av tre ytliga repor tillfogas6. Detta möjliggör också modellering av OA-progressionen till följd av broskskador orsakade av vissa kliniska ingrepp. Jämfört med den vanliga DMM-modellen resulterar den direkt inducerade broskskadan i konsekvent accelererad utskjutande osteofytbildning, ökad broskskada och inflammation och mätbar surrogatsmärta hos hanmöss.
Denna modell är särskilt lämplig för studier av posttraumatisk OA i tidigt skede, med fokus på osteofytbildning, smärtpresentation (hos hanmöss), synovit och tidiga förändringar av benparametrar. Konsistensen av osteofytbildning i denna modell gör det relevant att studera benreparation och endokondral benbildning eftersom osteofytbildning är en reparationsprocess via endokondral benbildning7. Modellen efterliknar också skador som införs direkt i brosket under kliniska ingrepp, såsom artroskopiska kirurgiska ingrepp, och därmed är den också lämplig för studier av effekten av broskskador på hela leden.
För att utföra kirurgisk induktion av posttraumatisk artros (PTOA) rekommenderas stöd från en assistent starkt (t.ex. för att förbereda mössen medan operatören fokuserar på operationen). Detta underlättar aseptisk kirurgi, vilket minskar riskerna för infektioner och gör interventionen effektivare i stora experiment. Det är lätt att tappa fokusplanet under operationen, så ett mikroskop som innehåller pedaler för fokusering är en värdefull funktion för att hjälpa till att upprätthålla sterilitet under hela operationen. Musens och knäets position är avgörande. Knäet måste vara vänt uppåt och tillräckligt böjt för att maximera öppningen av knäledsutrymmet, vilket underlättar åtkomst till ligamentet för att införa mikrobladet för att repa kondylytan. Att identifiera MMTL kan vara utmanande, särskilt när fettkudden är större än vanligt eller det finns en liten blödning. För att undvika blödningar, tryck fettkudden uppåt för att förhindra tårar och efterföljande blödning. Om fettkudden är stor kan det ta lite längre tid, men fortsätt tålmodigt att trycka den uppåt.
MMTL ligger ganska nära tibialkondylen, så man måste vara försiktig så att man inte skadar brosket när man placerar det nedre bladet på den böjda fjädersaxen under MMTL. De böjda bladen ska peka mot den mediala sidan och något uppåt, parallellt med kondylen. För bästa sektionering av MMTL, se till att saxen är skarp. Kontrollera att menisken kan röra sig medialt efter att ha klippt ligamentet, eftersom ibland kvarstår en liten fastsättning som behöver skäras ytterligare. När du introducerar mikrobladet för att repa kondylen måste den vara vinkelrätt mot kondylen. Gör den första repan närmare mitten av leden men var försiktig så att du inte skadar det främre korsbandet. Rör dig sedan mot den mediala sidan och sedan bakom menisken. Reporna kan vara synliga som svaga vita linjer på brosket. Eftersom vi vanligtvis använder klämmor utförs det första snittet på sidosidan, så klämmorna placeras på sidan av benet efter att såret har stängts. Detta undviker att klämmorna gnuggar knäet när musen återfår rörelse. Vid användning av suturer rekommenderas starkt användning av subdermala stygn. Om du använder yttre stygn, kommer mössen sannolikt att gnaga på stygnen och öppna sitt sår, vilket ökar risken för infektion. När det görs rätt får denna operation inte ta mer än 5-10 minuter, från snitt till sårförslutning, vilket minimerar exponeringen av brosket och eventuella ytterligare okontrollerade skador som kan uppstå. Efter operationen återhämtar sig mössen mycket snabbt och kan nästan omedelbart klättra in i buret och röra sig normalt. Om mössen inte är aktiva bör lämplig expert på enheten konsulteras.
För beteendeutvärdering av smärta bedömdes dynamisk viktbärande. Denna metod kan dock anses vara mindre känslig än andra framkallade smärttester, såsom von Frey-testning15. Det rekommenderas att mer än en metod används för att övervaka och bedöma smärta. De förändringar som observerats 2 veckor efter intervention i DCS, även om de är övergående, indikerar en generellt minskad belastning av OA-benet jämfört med det friska benet. Därför kan 2 veckor efter DCS-intervention användas för att utvärdera tidig artros- eller skadesmärta i musmodeller. Visualisering av mineraliserade osteofyter med μCT möjliggör tredimensionell kvantifiering, som också kan matchas med de histologiska sektionerna12, vilket ger ytterligare en dimension till studien av osteofytuppkomst och evolution. I vår grupp var osteofytnärvaron variabel i DMM-modellen mellan och inom operatörer (2,3 ± 1 mot 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), medan induktion av DCS robust ledde till osteofytgenerering i alla fall oavsett operatör (2,6 ± 0,7 mot 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Det finns också betydligt fler och större osteofyter i DCS-modellen jämfört med DMM. Således är DCS en idealisk modell för studier av osteofytbildning. Kvantifiering av osteoskleros begränsad till belastningsområdet för det subkondrala benet är också en förbättring för att upptäcka små förändringar. Att jämföra det mediala facket i det opererade benet med det kontralaterala benet erbjuder också ett sätt att normalisera mot den inneboende benfenotypen hos just den musen12. Tillsatsen av broskrepor i DCS-modellen är ett kontrollerat sätt att inducera fokuserade broskskador under operationen som påskyndar många av sjukdomsaspekterna. En av konsekvenserna av försöksförfarandet med avsiktlig skada på själva brosket är att denna arteffaktiska skada måste uteslutas eller justeras för i broskklassificeringssystemet. På grund av denna begränsning rekommenderar vi inte denna modell om studiens huvudsyfte är att förstå effekten av artros på själva brosket. Slutligen rekommenderas det också starkt att ha minst två blindade målskyttar som betygsätter broskskadan och synovitispoängen. Detta validerar och förbättrar standardiseringen av poängsystemen.
En begränsning i denna studie är att omfattningen av variationen mellan alla parametrar som jämför DCS- och DMM-modellerna inte utvärderades fullt ut. Detta kommer att behandlas i framtiden med mer omfattande studier, som också skulle kunna omfatta en bedömning av variationen mellan operatörer från olika institutioner.
Sammanfattningsvis möjliggör den accelererade OA-patogenesen i den nuvarande DCS-modellen representation av posttraumatisk OA och ger ett kraftfullt och robust forskningsverktyg för att undersöka och belysa underliggande OA-patofysiologiska mekanismer som driver denna kroniska försvagande ledsjukdom. Dessutom gör det möjligt för OA att utforskas i ett kortare tidsfönster, med fokus på osteofytogenes, OA-smärta och effekten av broskskador på hela leden.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill erkänna det arbete som utförts av Gemma Charlesworth och Mandie Prior vid University of Liverpool, som förvärvade μCT-bilderna som används i denna publikation. Arbetet finansierades av Versus Arthritis (bidrag 20199 och 22483). Lynette Dunning finansierades av Versus Arthritis (bidrag 20199). Kendal McCulloch finansierades av ett UWS-doktorandstipendium. Carmen Huesa finansierades av Versus Arthritis (bidrag 20199 och 22483).
#11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |