यह प्रोटोकॉल कैप्चर हाई-सी विधि का वर्णन करता है जिसका उपयोग उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस्ड आकार के लक्षित जीनोमिक क्षेत्रों के 3 डी संगठन को चिह्नित करने के लिए किया जाता है, जिसमें टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) की सीमाएं और नियामक और अन्य डीएनए अनुक्रम तत्वों के बीच लंबी दूरी की क्रोमैटिन इंटरैक्शन शामिल हैं।
जीनोम का स्थानिक संगठन प्रतिलेखन, प्रतिकृति, पुनर्संयोजन और मरम्मत सहित कई संदर्भों में इसके कार्य और विनियमन में योगदान देता है। जीनोम टोपोलॉजी और फ़ंक्शन के बीच सटीक कार्य-कारण को समझना इसलिए महत्वपूर्ण है और तेजी से गहन शोध का विषय है। क्रोमोसोम रचना कैप्चर प्रौद्योगिकियां (3 सी) जीनोम के किसी भी क्षेत्र के बीच बातचीत की आवृत्ति को मापकर क्रोमैटिन की 3 डी संरचना का अनुमान लगाने की अनुमति देती हैं। यहां हम कैप्चर हाई-सी करने के लिए एक तेज़ और सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, एक 3 सी-आधारित लक्ष्य संवर्धन विधि जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस्ड आकार के जीनोमिक लक्ष्यों के एलील-विशिष्ट 3 डी संगठन की विशेषता है। कैप्चर हाई-सी में, लक्ष्य क्षेत्रों को डाउनस्ट्रीम उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण से पहले बायोटिनीलेटेड जांच की एक सरणी द्वारा कैप्चर किया जाता है। इस प्रकार, प्रौद्योगिकी की समय-प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करते हुए उच्च रिज़ॉल्यूशन और एलील-विशिष्टता प्राप्त की जाती है। अपनी ताकत का प्रदर्शन करने के लिए, कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल को माउस एक्स-निष्क्रियता केंद्र (एक्सआईसी) पर लागू किया गया था, जो एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता (एक्ससीआई) का मास्टर नियामक स्थान है।
रैखिक जीनोम एक जीव के भ्रूण के विकास से गुजरने और वयस्कता के दौरान जीवित रहने के लिए आवश्यक सभी जानकारी रखता है। हालांकि, आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं को विभिन्न कार्यों को करने का निर्देश देना सटीक रूप से नियंत्रित करने के लिए मौलिक है कि विभिन्न ऊतकों और / या विकास ता्मक चरणों सहित विशिष्ट संदर्भों में कौन सी जानकारी का उपयोग किया जाता है। जीनोम के त्रि-आयामी संगठन को नियामक तत्वों के बीच भौतिक बातचीत को सुविधाजनक बनाने या रोकने के द्वारा जीन गतिविधि के इस सटीक स्थानिक-अस्थायी विनियमन में भाग लेने के लिए माना जाता है जिसे रैखिक जीनोम में कई सौ किलोबेस द्वारा अलग किया जा सकता है (समीक्षा के लिए 1,2,3;). पिछले 20 वर्षों में, जीनोम फोल्डिंग और गतिविधि के बीच परस्पर क्रिया की हमारी समझ तेजी से बढ़ी है, बड़े पैमाने पर क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर प्रौद्योगिकियों (3 सी) (समीक्षा के लिए 4,5,6,7) के विकास के कारण। ये विधियां जीनोम के किसी भी क्षेत्र के बीच बातचीत की आवृत्ति को मापती हैं और डीएनए अनुक्रमों के बंधाव पर भरोसा करती हैं जो नाभिक के भीतर 3 डी निकटता में हैं। सबसे आम 3 सी प्रोटोकॉल फॉर्मलाडेहाइड जैसे क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के साथ सेल आबादी के निर्धारण से शुरू होते हैं। क्रॉस-लिंक्ड क्रोमैटिन को तब एक प्रतिबंध एंजाइम के साथ पचाया जाता है, हालांकि MNase पाचन का भी उपयोग किया गया है 8,9. पाचन के बाद, निकट स्थानिक निकटता में मुक्त डीएनए को फिर से बंद कर दिया जाता है, और क्रॉस-लिंकिंग को उलट दिया जाता है। यह कदम 3 सी ‘लाइब्रेरी’ या ‘टेम्प्लेट’ को जन्म देता है, जो संकर टुकड़ों का एक मिश्रित पूल है जिसमें नाभिक के 3 डी निकटता में अनुक्रमों में एक ही डीएनए टुकड़े में लिगेट होने की अधिक संभावना होती है। इन हाइब्रिड टुकड़ों की डाउनस्ट्रीम मात्रा जीनोमिक क्षेत्रों के 3 डी अनुरूपण का अनुमान लगाने में सक्षम बनाती है जो रैखिक जीनोम में हजारों आधार जोड़े अलग स्थित हैं लेकिन 3 डी स्पेस में बातचीत कर सकते हैं।
3 सी लाइब्रेरी को चिह्नित करने के लिए कई अलग-अलग दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, दोनों के संदर्भ में अलग-अलग हैं कि लिगेशन टुकड़ों के उप-समूहों का विश्लेषण किया जाता है और उनके डाउनस्ट्रीम परिमाणीकरण के लिए किस तकनीक का उपयोग किया जाता है। मूल 3 सी प्रोटोकॉल रुचि के दो क्षेत्रों के चयन और पीसीआर10,11 द्वारा उनकी ‘एक बनाम एक’ इंटरैक्शन आवृत्ति की मात्रा का ठहराव पर निर्भर था। 4 सी दृष्टिकोण (परिपत्र गुणसूत्र रचना कैप्चर) रुचि के एकल स्थान (यानी, ‘दृश्य-बिंदु’) और शेष जीनोम (‘एक बनाम सभी’) 12,13,14 के बीच बातचीत को मापता है। 4 सी में, 3 सी लाइब्रेरी छोटे गोलाकार डीएनए अणुओं को उत्पन्न करने के लिए पाचन और पुन: बंधाव के दूसरे दौर से गुजरती है जो पीसीआर को दृश्य-बिंदु विशिष्ट प्राइमर15 द्वारा प्रवर्धित किया जाता है। 5 सी (क्रोमोसोम रचना कैप्चर कार्बन कॉपी) रुचि के बड़े क्षेत्रों में 3 डी इंटरैक्शन के लक्षण वर्णन को सक्षम बनाता है, जो उस क्षेत्र के भीतर उच्च-क्रम क्रोमैटिन फोल्डिंग में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है (‘कई बनाम कई‘)। 5 सी में, 3 सी लाइब्रेरी को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स ओवरलैपिंग प्रतिबंध साइटों के एक पूल में संकरित किया जाता है जिसे बाद में सार्वभौमिक प्राइमर15 के साथ मल्टीप्लेक्स पीसीआर द्वारा प्रवर्धित किया जा सकता है। 4 सी और 5 सी दोनों में, सूचनात्मक डीएनए टुकड़े शुरू में माइक्रोएरे द्वारा निर्धारित किए गए थे और बाद में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) 17,18,19 द्वारा। ये रणनीतियाँ रुचि के लक्षित क्षेत्रों को चिह्नित करती हैं लेकिन जीनोम-व्यापक इंटरैक्शन को मैप करने के लिए लागू नहीं की जा सकती हैं। यह उत्तरार्द्ध लक्ष्य हाई-सी, एक 3 सी-आधारित उच्च-थ्रूपुट रणनीति के साथ प्राप्त किया जाता है जिसमें 3 सी टेम्पलेट के बड़े पैमाने पर समानांतर अनुक्रमण जीनोम-वाइड स्तर (‘सभी बनाम सभी‘) पर क्रोमैटिन फोल्डिंग के निष्पक्ष लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। हाई-सी प्रोटोकॉल में पचे हुए टुकड़ों के सिरों पर एक बायोटिनीलेटेड अवशेष को शामिल करना शामिल है, जिसके बाद लिगेटेड टुकड़ों की वसूली को बढ़ाने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन मोतियों के साथ बंधाव के टुकड़ों को खींचना शामिलहै।
हाय-सी से पता चला कि स्तनधारी जीनोम संरचनात्मक रूप से 3 डी नाभिक में कई पैमानों पर व्यवस्थित होते हैं। मेगाबेस पैमाने पर, जीनोम को सक्रिय और निष्क्रिय क्रोमैटिन, ए और बी डिब्बों के क्षेत्रों में विभाजित किया गया है, क्रमशः20,21। विभिन्न क्रोमैटिन और गतिविधि राज्यों द्वारा दर्शाए गए आगे के उपडिब्बों का अस्तित्व भी बाद मेंदिखाया गया था। उच्च रिज़ॉल्यूशन पर, जीनोम को आगे उप-मेगाबेस स्व-अंतःक्रियात्मक डोमेन में विभाजित किया जाता है जिसे टोपोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन (टीएडी) कहा जाता है, जो पहली बार मानव और माउस जीनोम23,24 के हाई-सी और 5 सी विश्लेषण द्वारा प्रकट किया गया था। डिब्बों के विपरीत जो ऊतक-विशिष्ट तरीके से भिन्न होते हैं, टीएडी स्थिर होते हैं (हालांकि कई अपवाद हैं)। महत्वपूर्ण रूप से, टीएडी सीमाओं को प्रजातियों25 में संरक्षित किया जाता है। स्तनधारी कोशिकाओं में, टीएडी अक्सर एक ही नियामक परिदृश्य को साझा करने वाले जीन को शामिल करते हैं और एक संरचनात्मक ढांचे का प्रतिनिधित्व करने के लिए दिखाया गया है जो पड़ोसी नियामक डोमेन के साथ बातचीत को सीमित करते हुए जीन सह-विनियमन की सुविधा प्रदान करता है (समीक्षा के लिए 3,26,27,28)। इसके अलावा, टीएडी के भीतर, कोहेसिन-एक्सट्रूडेड लूप के आधार पर सीटीसीएफ साइटों के कारण बातचीत प्रमोटर-एन्हांसर या एन्हांसर-एन्हांसर इंटरैक्शन की संभावना को बढ़ा सकती है (समीक्षा29 के लिए)।
हाई-सी में, डिब्बों और टीएडी को 1 एमबी से 40 केबी रिज़ॉल्यूशन पर पाया जा सकता है, लेकिन 5-10 केबी के पैमाने पर डिस्टल तत्वों के बीच लूपिंग इंटरैक्शन जैसे छोटे पैमाने के संपर्कों को चिह्नित करने के लिए उच्च रिज़ॉल्यूशन प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, एचआईसी द्वारा कुशलतापूर्वक ऐसे लूप का पता लगाने में सक्षम होने के लिए रिज़ॉल्यूशन बढ़ाने के लिए अनुक्रमण गहराई में उल्लेखनीय वृद्धि की आवश्यकता होती है और इसलिए, अनुक्रमण लागत। यदि विश्लेषण को एलील-विशिष्ट होने की आवश्यकता होती है तो यह बढ़ जाता है। दरअसल, रिज़ॉल्यूशन में एक्स-गुना वृद्धि के लिए अनुक्रमण गहराई में एक्स2 वृद्धि की आवश्यकता होती है, जिसका अर्थ है कि उच्च-रिज़ॉल्यूशन और एलील-विशिष्ट जीनोम-वाइड दृष्टिकोण निषेधात्मक रूपसे महंगे हो सकते हैं।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन को बनाए रखते हुए लागत-प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करने के लिए, डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण से पहले पूरक बायोटिन-लेबल ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड जांच के साथ संकरण के बाद जीनोम-वाइड 3 सी या हाई-सी पुस्तकालयों से रुचि के लक्षित क्षेत्रों को शारीरिक रूप से नीचे खींचा जा सकता है। इन लक्ष्य संवर्धन रणनीतियों को कैप्चर-सी विधियों के रूप में संदर्भित किया जाता है और जीनोम में बिखरे सैकड़ों लक्ष्य लोकी की बातचीत की पूछताछ की अनुमति देता है (यानी, प्रमोटर कैप्चर (पीसी) हाई-सी; अगली पीढ़ी (एनजी) कैप्चर-सी; कम इनपुट (एलआई) कैप्चर-सी; न्यूक्लियर टाइटरेटेड (एनयूटीआई) कैप्चर-सी; ट्राई-सी) 31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, या कई मेगाबेस तक फैले क्षेत्रों में (यानी, कैप्चर एचआईसी; एचवाईब्रिड कैप्चर हाई-सी (हाई-सी2); टाइल-सी) 41,42,43। कैप्चर-आधारित विधियों में दो पहलू भिन्न हो सकते हैं: (1) बायोटिनीलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स की प्रकृति और डिजाइन (यानी, आरएनए या डीएनए, बिखरे हुए जीनोमिक लक्ष्यों को कैप्चर करने वाले एकल ऑलिगोस या रुचि के क्षेत्र को कवर करने वाले कई ऑलिगो); और (2) टेम्प्लेट जिसका उपयोग लक्ष्यों को नीचे खींचने के लिए किया जाता है जो 3 सी या हाई-सी लाइब्रेरी हो सकता है, बाद में 3 सी लाइब्रेरी से नीचे खींचे गए बायोटिनीलेटेड प्रतिबंध टुकड़े शामिल हैं।
यहां, 3 सी लाइब्रेरी से लक्ष्य संपर्कों के संवर्धन के आधार पर एक कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। प्रोटोकॉल बायोटिनीलेटेड आरएनए जांच की एक कस्टम-अनुरूप टाइलिंग सरणी के डिजाइन पर निर्भर करता है और 3 सी लाइब्रेरी की तैयारी से एनजीएस अनुक्रमण तक 1 सप्ताह में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल तेज, सरल है, और अन्य 3 सी विधियों की तुलना में समय प्रभावशीलता और सामर्थ्य में सुधार करते हुए 5 केबी रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस-आकार के क्षेत्रों के उच्च क्रम 3 डी संगठन को चिह्नित करने की अनुमति देता है। कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल को एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता (एक्ससीआई), एक्स-निष्क्रियता केंद्र (एक्सआईसी) के मास्टर नियामक स्थान पर लागू किया गया था, जो एक्सिस्ट नॉनकोडिंग आरएनए को होस्ट करता है। Xic पहले व्यापक संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण का विषय रहा है (समीक्षा के लिए44,45)। स्तनधारियों में, एक्ससीआई महिलाओं (XX) और पुरुषों (XY) के बीच एक्स-लिंक्ड जीन की खुराक की भरपाई करता है और इसमें महिला कोशिकाओं में दो एक्स गुणसूत्रों में से एक की लगभग संपूर्णता की ट्रांसक्रिप्शनल साइलेंसिंग शामिल है। Xic ने 3D जीनोम टोपोलॉजी और जीन विनियमन44 के साथ परस्पर क्रिया में अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली, स्वर्ण मानक स्थान का प्रतिनिधित्व किया है। माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एमईएससी) में एक्सआईसी के 5 सी विश्लेषण ने टीएडी की खोज और नामकरण का नेतृत्व किया, जो टोपोलॉजिकल विभाजन और जीन सह-विनियमन24 की कार्यात्मक प्रासंगिकता में पहली अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। Xic के टोपोलॉजिकल संगठन को बाद में Xist अपरेगुलेशन और XCI 46 के उपयुक्त विकास समय में गंभीर रूप से शामिल दिखाया गया था, और असंदिग्ध सीआईएस-नियामक तत्व जो टीएडी के भीतर और बीच जीन गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, उन्हें हाल ही में Xic47,48,49 के भीतर खोजा गया था। एक्सिक में फैले माउस एक्स क्रोमोसोम के 3 एमबी पर कैप्चर हाई-सी लागू करना उच्च रिज़ॉल्यूशन पर बड़े पैमाने पर क्रोमैटिन फोल्डिंग को विच्छेदित करने में इस दृष्टिकोण की शक्ति को दर्शाता है। एक विस्तृत और आसानी से पालन किया जाने वाला प्रोटोकॉल प्रदान किया जाता है, जो रुचि के क्षेत्र के भीतर प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट पर बायोटिनीलेटेड जांच की सरणी के डिजाइन से शुरू होकर जीनोम-वाइड 3 सी लाइब्रेरी की पीढ़ी, संकरण और लक्ष्य संपर्कों को कैप्चर करने और डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण तक होता है। उपयुक्त गुणवत्ता नियंत्रण और अपेक्षित परिणामों का अवलोकन भी शामिल है, और समान मौजूदा तरीकों के प्रकाश में दृष्टिकोण की ताकत और सीमाओं दोनों पर चर्चा की जाती है।
यहां हम 5-10 केबी रिज़ॉल्यूशन पर मेगाबेस-आकार के जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-क्रम संगठन को चिह्नित करने के लिए अपेक्षाकृत त्वरित और आसान कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। कैप्चर हाई-सी कैप्चर-सी प्रौद्योगिकियों के परिवार से संबंधित है जो जीनोम-वाइड 3 सी या हाई-सी टेम्प्लेट से लक्षित क्रोमैटिन इंटरैक्शन को समृद्ध करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं। आज तक, कैप्चर-सी अनुप्रयोगों के बड़े बहुमत का उपयोग पूरे जीनोम में बिखरे हुए अपेक्षाकृत छोटे नियामक तत्वों के क्रोमैटिन संपर्कों को मैप करने के लिए किया गया है। पहले कैप्चर-सी प्रोटोकॉल में, एरिथ्रोइड कोशिकाओं31 से तैयार 3 सी पुस्तकालयों में >400 पूर्व-चयनित प्रमोटरों को पकड़ने के लिए कई अतिव्यापी आरएनए बायोटिनीलेटेड जांच का उपयोग किया गया था। इसी रणनीति में बाद में नेक्स्ट जनरेशन (एनजी) और न्यूक्लियर टाइटरेटेड (एनयूटीआई) कैप्चर-सी में सुधार किया गया ताकि एकल प्रतिबंध स्थलों पर फैले एकल 120 बीपी डीएनए चारा और कैप्चर के दो अनुक्रमिक राउंड का उपयोग करके >8,000 प्रमोटरों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन इंटरैक्शन प्रोफाइल को प्राप्त किया जा सके।. इन रणनीतियों ने कई अलग-अलग संदर्भों में सीआईएस-अभिनय तत्वों के कार्यात्मक विच्छेदन का नेतृत्व किया, जिसमें माउस भ्रूण विकास, सेल भेदभाव, एक्स-क्रोमोसोम निष्क्रियता, और पैथोलॉजिकल स्थितियों में जीन मिस-विनियमन 46,63,65,66,67,68,69,70,71 शामिल हैं।
प्रमोटर कैप्चर हाई-सी (पीसीएचआई-सी) में, प्रतिबंध टुकड़े34,72 के एक या दोनों सिरों पर एकल आरएनए 120-मेर बायोटिनीलेटेड जांच के संकरण द्वारा प्रतिबंध टुकड़े वाले >22,000 एनोटेटेड प्रमोटरों को हाई-सी पुस्तकालयों से नीचे खींच लिया गया था। इस विधि ने माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं, भ्रूण यकृत कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स 34,35,72,73 सहित सेल प्रकारों की तेजी से बढ़ती संख्या में हजारों प्रमोटरों के इंटरैक्शन के विच्छेदन की अनुमति दी, लेकिन मानव लिम्फोब्लास्टोइड लाइनें, हेमटोपोइएटिक पूर्वज, एपिडर्मल केराटिनोसाइट्स और प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं37,74,75,76,77 भी शामिल हैं।.
इन लक्ष्य संवर्धन प्रौद्योगिकियों की तुलना में, कैप्चर हाई-सी मेगाबेस पैमाने तक सन्निहित जीनोमिक क्षेत्रों को लक्षित करता है, जिससे एक या अधिक टीएडी का विस्तार होता है और जीन के नियामक परिदृश्य शामिल होते हैं। रुचि के पूरे क्षेत्र को लक्ष्य के भीतर प्रत्येक डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइट को शामिल करते हुए बायोटिनीलेटेड जांच की एक सरणी के साथ जोड़ा जाना चाहिए। 3 सी टेम्पलेट में बायोटिनीलेटेड सरणी का संकरण, इसके बाद स्ट्रेप्टाविडिन-आधारित कैप्चर, और मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए प्रसंस्करण इलुमिना पेयर्ड-एंड मल्टीप्लेक्स अनुक्रमण के लिए लक्ष्य संवर्धन प्रणाली का उपयोग करके किया जाता है। पूरा प्रोटोकॉल तेज़ है, क्योंकि इसे एनजीएस अनुक्रमण के माध्यम से 3 सी लाइब्रेरी की तैयारी से 1 सप्ताह में किया जा सकता है, और इसके लिए केवल मामूली अनुकूलन और / या कस्टम-विशिष्ट समस्या निवारण की आवश्यकता होती है।
प्रोटोकॉल अन्य 3 सी-आधारित विधियों की तुलना में भी लाभ प्रदान करता है। 5-10 केबी के रिज़ॉल्यूशन पर इंटरैक्शन मैप प्राप्त करने के लिए, हमने 100-120 एम पेयर-एंड रीड को अनुक्रमित किया। तुलना के रूप में, हमने यहां 20 केबी रिज़ॉल्यूशन64 (जीएसएम 2053973) तक पहुंचने के लिए 571 एम रीड के एक हाई-सी डेटासेट का उपयोग किया, और क्रोमोसोम-वाइड हाई-सी22 के साथ 5 केबी रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचने के लिए कम से कम 1 बिलियन रीड की आवश्यकता होगी।
वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए गए कैप्चर हाई-सी 6-बीपी कटर प्रतिबंध एंजाइम47 (पूरक तालिका 1) के आधार पर पहले प्रकाशित 5 सी की तुलना में बहुत अधिक रिज़ॉल्यूशन तक पहुंचता है। महत्वपूर्ण रूप से, 5 सी में लक्षित इंटरैक्शन को समृद्ध और बढ़ाने के लिए डिज़ाइन की गई रणनीति क्रोमैटिन इंटरैक्शन के एलील-विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति नहीं देती है। इसके विपरीत, कैप्चर हाई-सी डेटा को एलील-विशेष रूप से मैप किया जा सकता है, जिससे समरूप गुणसूत्रों के जोड़े के 3 डी संरचनात्मक परिदृश्य के विच्छेदन की अनुमति मिलती है, उदाहरण के लिए मानव कोशिकाओं में या आनुवंशिक रूप से भिन्न माउस उपभेदों78 को पार करके प्राप्त एफ 1 हाइब्रिड सेल लाइनों में। 5 केबी रिज़ॉल्यूशन पर एलील-विशिष्ट कैप्चर हाई-सी इंटरैक्शन मैप उत्पन्न करने के लिए, हमने एसएनपी कवरेज बढ़ाने के लिए 150 बीपी पेयर-एंड रीड को अनुक्रमित किया। इसी तरह के एलील-विशिष्ट दृष्टिकोण मानव सेल लाइनों पर लागू किए जा सकते हैं, जिसके लिए एसएनपी का एनोटेशनउपलब्ध है।
महत्वपूर्ण रूप से, हालांकि कैप्चर हाई-सी आम तौर पर अनुक्रमण लागत की सामर्थ्य में सुधार करते हुए उच्च रिज़ॉल्यूशन सुनिश्चित करता है, कस्टम-अनुरूप बायोटिनीलेटेड ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स का उत्पादन इस विधि की समग्र लागत पर प्रभाव डालता है। इसलिए, सबसे उपयुक्त 3 सी विधि की पसंद विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए अलग-अलग होगी, और जैविक प्रश्न पर निर्भर करेगी जिसे संबोधित किया जा रहा है और आवश्यक समाधान, साथ ही साथ रुचि के क्षेत्र का आकार भी। विकसित अन्य कैप्चर हाई-सी प्रोटोकॉल यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ प्रमुख विशेषताओं को साझा करते हैं। उदाहरण के लिए, स्तन और कोलोरेक्टल कैंसर के जोखिम से जुड़े नॉनकोडिंग वेरिएंट में फैले ~ 50 केबी से 1 एमबी जीनोमिक क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए एक कैप्चर हाई-सी रणनीति लागू की गई थी; इस प्रोटोकॉल में, लक्षित क्षेत्रों को33,38,79 के 3x कवरेज पर लक्षित क्षेत्रों को 120-मेर आरएनए चारा को हाइब्रिड करके हाई-सी पुस्तकालयों से नीचे खींच लिया गया था। इसी तरह, एचवाईब्रिड कैप्चर हाई-सी (हाई-सी 2) का उपयोग2 एमबी80 तक रुचि के क्षेत्रों के भीतर बातचीत को लक्षित करने के लिए किया गया था। दोनों प्रोटोकॉल में, बायोटिन खींचे गए लिगेशन टुकड़ों के लिए समृद्ध हाई-सी टेम्पलेट के उपयोग ने हमारे प्रोटोकॉल की तुलना में कुल सूचनात्मक पढ़ने का प्रतिशत बढ़ा दिया। उदाहरण के लिए, तुलना64 (GSM2053973) के लिए हमने यहां जिस हाई-सी डेटासेट का उपयोग किया है, उसमें डुप्लिकेट को हटाने के बाद मान्य जोड़े का प्रतिशत कैप्चर हाई-सी में प्राप्त वैध जोड़े की तुलना में 4.8 गुना अधिक है जैसा कि चित्रा 3 और पूरक तालिका 1 में वर्णित है। हालांकि, बायोटिनीलेटेड लिगेटेड टुकड़ों और संकरीकृत जांच के लगातार पुल-डाउन प्रोटोकॉल को काफी अधिक जटिल और समय लेने वाला बनाते हैं, जबकि संभवतः कैप्चर किए गए क्षेत्र की जटिलता को कम करते हैं।
टाइलिंग जांच के साथ 3 सी टेम्प्लेट को समृद्ध करने के लिए एक और उपलब्ध विधि टाइल-सी है, जिसे माउस एरिथ्रोइड भेदभाव43 के दौरान उच्च स्थानिक और लौकिक रिज़ॉल्यूशन पर क्रोमैटिन आर्किटेक्चर का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया था। टाइल-सी में, 70 बीपी बायोटिनीलेटेड प्रोब्स के एक पैनल का उपयोग बड़े पैमाने पर क्षेत्रों के भीतर संपर्कों को समृद्ध करने के लिए किया जाता है, जो लक्षित इंटरैक्शन43,81 के बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र उत्पन्न करने के लिए कैप्चर के लगातार दो दौर में होते हैं। कैप्चर हाई-सी की तुलना में डबल कैप्चर संवर्धन प्रोटोकॉल को लंबा और अधिक जटिल बनाता है। हालांकि, एकल प्रतिबंध साइटों को लक्षित करने वाली कैप्चर-सी रणनीतियों से अलग, टाइल्ड-सी में कैप्चर का दूसरा दौर कैप्चर दक्षता में काफी वृद्धि नहीं करता है, और इसलिए इसे संभवतःछोड़ा जा सकता है। अंत में, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एक ही लक्ष्य संवर्धन रणनीति के आधार पर एक समान टाइलिंग दृष्टिकोण को जन्मजात विकृतियों वाले रोगियों में वर्णित संरचनात्मक रूपों को शामिल करने वाले नियामक परिदृश्यों के विच्छेदन पर लागू किया गया था और ट्रांसजेनिक चूहों41,42 में फिर से इंजीनियर किया गया था। इस मामले में, जांच की टाइलिंग सरणी को डीपीएनआईआई प्रतिबंध साइटों41 की निकटता के बजाय पूरे लक्ष्य में डिज़ाइन किया गया था। फिर भी, यह काम विभिन्न संदर्भों में बड़े जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन को प्राप्त करने के लिए इस रणनीति की संवेदनशीलता और शक्ति को उजागर करने में मौलिक था।
अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल रुचि के किसी भी जीनोमिक क्षेत्रों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी लक्षण वर्णन के लिए एक आसान, मजबूत और शक्तिशाली रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। विभिन्न मॉडल प्रणालियों, सेल प्रकारों, विकास-विनियमित क्रोमैटिन परिदृश्य, और स्वस्थ और रोग स्थितियों में जीन विनियमन के लिए इस दृष्टिकोण का अनुप्रयोग जीनोम टोपोलॉजी और जीन विनियमन के बीच परस्पर क्रिया और कार्य-कारण की हमारी समझ को सुविधाजनक बनाने की संभावना है, जो एपिजेनेटिक्स क्षेत्र में मौलिक खुले प्रश्नों में से एक है। इसके अलावा, जीडब्ल्यूएएस अध्ययनों द्वारा पहचाने गए जोखिम वेरिएंट के लंबी दूरी के इंटरैक्शन और उच्च-क्रम क्रोमैटिन फोल्डिंग को मैप करने के लिए कैप्चर हाई-सी को लागू करने से विभिन्न संदर्भों में मानव रोगों से जुड़े नॉनकोडिंग जीनोमिक लोकी की कार्यात्मक प्रासंगिकता को प्रकट करने की क्षमता है, जिससे संभावित रूप से अंतर्निहित रोगजनन प्रक्रियाओं में नवीन अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है।
The authors have nothing to disclose.
हर्ड प्रयोगशाला में काम को यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत अन्वेषक पुरस्कार (एक्सप्रेस – एडीजी 671027) द्वारा समर्थित किया गया था। ए.एल. को यूरोपीय संघ मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी एक्शन व्यक्तिगत फैलोशिप (आईएफ -838408) द्वारा समर्थित किया गया है। एएच को आईटीएन इनोवेटिव और इंटरडिसिप्लिनरी नेटवर्क क्रोमडिज़ाइन द्वारा समर्थित किया गया है, जो मैरी स्कोलोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट समझौते के तहत 813327। लेखक सहायक तकनीकी सलाह के लिए डैनियल इब्राहिम (आणविक आनुवंशिकी के लिए एमपीआई, बर्लिन), इंस्टीट्यूट क्यूरी (पेरिस) में एनजीएस प्लेटफॉर्म और समर्थन और सहायता के लिए ईएमबीएल (हीडलबर्ग) में व्लादिमीर बेनेस और जीनोमिक्स कोर सुविधा के लिए आभारी हैं।
10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Cell Scrapers – 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
Proteinase K – recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |