Her præsenterer vi en protokol til isolering af murine intestinal mesenchym, herunder telocytter. Disse kan bruges til flere applikationer, såsom samkultur med mus eller menneskeafledte organoider, for at understøtte vækst og bedre afspejle situationen i det oprindelige væv.
Den murin tyndtarmen, eller kolon mesenchyme, er meget heterogen, der indeholder forskellige celletyper, herunder blod og lymfatisk endotel, nerver, fibroblaster, myofibroblaster, glatte muskelceller, immunceller, og den nyligt identificerede celletype, telocytter. Telocytter er unikke mesenkymale celler med lange cytoplasmatiske processer, der når en afstand på titusinder til hundreder af mikron fra cellekroppen. Telocytter er for nylig opstået som en vigtig tarmstamcellenichekomponent, der giver Wnt-proteiner, der er afgørende for stam- og stamcelleproliferation.
Selvom protokoller om, hvordan man isolerer mesenchym fra musetarmen, er tilgængelige, er det ikke klart, om disse procedurer tillader effektiv isolering af telocytter. Isolering af telocytter effektivt kræver specielle protokoljusteringer, der muliggør dissociation af den stærke celle-cellekontakt mellem telocytter og naboceller uden at påvirke deres levedygtighed. Her blev tilgængelige intestinale mesenchymeisoleringsprotokoller justeret for at understøtte den vellykkede isolering og dyrkning af mesenchyme, der indeholder et relativt højt udbytte af levedygtige enkeltcelle-telocytter.
Den opnåede enkeltcellesuspension kan analyseres ved flere teknikker, såsom immunfarvning, cellesortering, billeddannelse og mRNA-eksperimenter. Denne protokol giver mesenchym med tilstrækkeligt konserverede antigene og funktionelle egenskaber af telocytter og kan bruges til flere applikationer. For eksempel kan de bruges til samkultur med muse- eller menneskeafledte organoider for at understøtte organoidvækst uden vækstfaktortilskud for bedre at afspejle situationen i det oprindelige væv.
Både tyndtarmen og tyktarmen er stærkt regenerative væv på grund af tilstedeværelsen af stamceller, som formerer sig og brænder regenerering1. Mesenchymet omkring epitelet giver strukturel og funktionel støtte ved at udskille ekstracellulære matrixproteiner og signalmolekyler2, som modulerer responsen af epitelceller. Telocytter er store mesenkymale celler, hovedsageligt beskrevet hidtil ved elektronmikroskopi som celler med lange cytoplasmatiske processer kaldet telopoder, som overlapper hinanden for at skabe et labyrintisk netværk 3,4,5,6,7. For nylig er intestinale telocytter, der udtrykker transkriptionsfaktoren FOXL1, opstået som en vigtig stamcellenichekomponent, der leverer Wnt-proteiner, som er afgørende for stam- og stamcellefunktion. Intestinale telocytter udtrykker høje niveauer af vigtige signalvejsproteiner såsom Wnt, Bmp, Tgfb og Shh samt mange vækstfaktorer8.
Da telocytter er en kritisk stamcellenichekomponent in vivo, vil udvikling af protokoller til isolering og dyrkning af dem ex vivo gøre det muligt at anvende dem som en kilde til signalmolekyler og vækstfaktorer for at understøtte vækst og differentiering ex vivo. Ved hjælp af veletablerede protokoller kan kolon- eller tarmepitelkrypter isoleres og danne 3D-strukturer kendt som organoider 9,10,11. Tredimensionelle organoider repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at undersøge både fysiologien og patologien i tarmepitelet ex vivo. I et ex vivo-system er organoider afhængige af eksogent tilskud af faktorer for overlevelse og vækst10. Isoleret mesenchyme kan dyrkes med både mus og humanafledte organoider og anvendes som en kilde til vækstfaktorer i stedet for eksogent tilskud for bedre at afspejle situationen i det oprindelige væv. Undersøgelse af telocytter ex vivo har adskillige fordele ved at undersøge normal eller patologisk cellulær adfærd, mekanismer for vævshomeostase og celle-celleinteraktioner mere detaljeret.
Selvom protokoller, der beskriver, hvordan man isolerer mesenchym fra musetarmen, er tilgængelige, er det ikke klart, om disse procedurer resulterer i effektiv isolering af telocytter. Vellykket isolering af telocytter kræver særlige protokoljusteringer, der muliggør dissociation af den stærke celle-cellekontakt mellem telocytterne og nabocellerne uden at påvirke deres levedygtighed. For at overvinde disse begrænsninger præsenterer dette papir en modificeret protokol, der konsekvent giver en meget levedygtig, enkeltcellesuspension indeholdende en relativt høj mængde telocytter med tilstrækkeligt konserverede antigene og funktionelle egenskaber. Disse telocytter kan bruges til flere applikationer, herunder samkultur med muse- eller humanafledte organoider, for at understøtte vækst uden vækstfaktortilskud. Dette afspejler igen bedre situationen i det oprindelige væv.
Vi brugte FOXL1-Cre: Rosa-mTmG-musemodel8, hvor telocytter er mærket med en membranbundet version af grønt fluorescerende protein (GFP) i grønt, hvilket gør det muligt for efterforskeren at følge telocytter i deres helhed; alle de andre mesenkymale celler er mærket med en membranbundet tdTomat i rødt. Den nuværende protokol blev ændret fra en protokol, der isolerer intestinal mesenchyme12 for at forbedre telocytudbyttet og levedygtigheden.
Her udviklede vi en protokol til at isolere mesenchyme fra musetyndtarmen ved hjælp af FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG-musemodellen, som gør det muligt for forskere at skelne telocytter fra andre mesenkymale celler. Der er nogle kritiske trin, der skal følges i denne protokol. For det første er det vigtigt at ryste røret kraftigt ved fire eller fem cyklusser / s for at kassere størstedelen af epitelceller under mesenkymisolering. Inkubationstiden for enzymatisk fordøjelse skal optimeres baseret på fordøjelseseffektivitet. Under inkubationen skal pladerne forsigtigt rystes vandret i nogle få sekunder hvert 20. minut. Når vævet bliver filamentlignende, skal inkubationen stoppes ved at fortsætte til protokoltrin 2.12. Udsættelse af vævet for lange fordøjelsestider kan resultere i lav cellelevedygtighed og udbytte. Efter enzymatisk fordøjelse skal røret rystes mekanisk for at frigive flere enkeltceller i suspension; Ideelt set skal opløsningen se overskyet ud, og ingen vævsfragmenter skal være synlige. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du forlænge den enzymatiske fordøjelse til 60 min.
At holde sterile forhold og undgå potentiel bakteriel kontaminering er et af de kritiske trin, når man arbejder med primær vævskultur. Der skal anvendes sterile dissekeringsværktøjer, reagenser og buffere; Handsker skal ændres, og arbejdsområdet skal rengøres, når der arbejdes med dyr. Når cellesuspensionen er opnået, skal arbejdet udføres under en laminær biologisk hætte. Efter plettering skal cellerne inkuberes natten over uden forstyrrelser, da dette kan påvirke vedhæftningen. Derudover er det vigtigt at udskifte dyrkningsmediet en dag efter såning, da ikke-klæbende celler kan påvirke dyrkningens levedygtighed.
Overflademarkører, der anvendes i denne protokol, reagerede stærkt med deres epitoper; Det er dog muligt, at enzymatisk fordøjelse kan påvirke bindingsreaktivitet og derfor FACS-analyseresultater. En anden begrænsning af denne protokol er underrepræsentationen af muskulaturen. For at forbedre effektiviteten af muskellagscelleisolering anbefaler vi mekanisk adskillelse af musklen fra slimhindelagene og separat enzymatisk fordøjelse for hvert af lagene. Til dissociering af epitelet fra stromaen kan enten mekaniske separations- eller chelateringsmidler (EDTA eller DTT) anvendes; Imidlertid er enzymatisk fordøjelse til opnåelse af enkeltceller blevet optimeret i denne protokol.
Isolering af intestinal mesenchym er tidligere beskrevet8; skrabning af villi med en coverslip ville medføre tab af noget mesenchyme sammen med villus, især villus tip mesenkymale celler såsom Lgr5 + villus tip telocytter13. I denne protokol bruger vi collagenase type VIII i stedet for dispase II og trypsin i kombination med DNase I, da collagenase mere effektivt frigiver mesenkymale celler fra matrixen. Selvom det forlænger behandlingstiden (>90 min vs. 35 min), gav de to protokoller lignende cellelevedygtighedshastigheder; Den nuværende protokol forbedrede udbyttet af mesenkymale celler generelt og mere specifikt af telocytfraktionen. Den nuværende protokol gav ca. 10% GFP+ telocytter, bekræftet både ved visualisering og ved FACS-analyse, mens den tidligere protokol gav 2% GFP+ telocytter. De væsentligste forskelle mellem den nuværende protokol og de to referenceprotokoller er anført i supplerende tabel S1.
Identifikationen af FOXL1+GFP+ celler som subepitelocytter er baseret på in vivo studier. Behovet for at udvikle og modificere tilgængelige mesenchymeisolationsprotokoller for at producere højere udbytter af telocytter og viden om, hvordan man opnår dette, var baseret på vores forståelse af strukturen og funktionen af FOXL1+ telocytter in vivo, som store celler med lange cellulære fremspring tæt knyttet til epitelceller.
Interessant nok udviser ex vivo GFP + telocytter cellulære egenskaber svarende til deres egenskaber in vivo i tarmen og foreslås derfor at tjene som en ideel støtte til organoidvækst. Selvom denne protokol hovedsageligt diskuterer telocytisolering fra tyndtarmen, kan en lignende protokol med mindre modifikation anvendes og let anvendes til kolon mesenkymale celler, såsom den nyligt beskrevne MAP3K2-regulerede intestinale stromale celle (MRISC)12.
Når mesenkymale celler har strakt sig og nået sammenløb, kan de bruges til flere yderligere applikationer, såsom 3D-cokultur med mus- eller menneskeafledte organoider ved hjælp af vækstfaktorfri Matrigel. Mesenchymet danner typisk et netværk, der fuldt ud understøtter organoid dannelse og vækst uden eksogent vækstfaktortilskud. Tarmstroma har iboende 3D-funktioner, der kan give epitelet mekanisk støtte14. Derfor kan denne protokol også bruges til at isolere mesenchyme, der skal integreres i et 3D bio-printet stillads og bruges til yderligere xenografteksperimenter.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Israel Science Foundation (MSC personlig bevilling) og det fælles program mellem Israel Science Foundation og National Natural Science Foundation of China.
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |