在这里,我们提出了一种分离小鼠肠间充质(包括端细胞)的方案。这些可用于多种应用,例如与小鼠或人源性类器官共培养,以支持生长并更好地反映原始组织中的情况。
小鼠小肠或结肠间充质是高度异质的,包含不同的细胞类型,包括血液和淋巴内皮、神经、成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、免疫细胞和最近鉴定的细胞类型端细胞。端细胞是独特的间充质细胞,具有长细胞质过程,距离细胞体达到数十至数百微米的距离。端细胞最近已成为重要的肠道干细胞生态位成分,提供对干细胞和祖细胞增殖至关重要的Wnt蛋白。
尽管有关如何从小鼠肠道中分离间充质的方案是可用的,但尚不清楚这些程序是否允许有效分离端细胞。有效地分离端细胞需要特殊的方案调整,这将允许解离端细胞和邻近细胞之间的强细胞 – 细胞接触,而不会影响其活力。在这里,调整了可用的肠道间充质分离方案,以支持成功分离和培养含有相对高产量的活单细胞端细胞的间充质。
获得的单细胞悬液可以通过多种技术进行分析,例如免疫染色、细胞分选、成像和 mRNA 实验。该方案产生具有足够保守的端细胞抗原和功能特性的间充质,可用于多种应用。例如,它们可用于与小鼠或人源性类器官共培养,以支持类器官生长,无需补充生长因子,以更好地反映原始组织中的情况。
由于干细胞的存在,小肠和结肠都是高度再生的组织,干细胞会增殖并推动再生1。上皮周围的间充质通过分泌调节上皮细胞反应的细胞外基质蛋白和信号分子2提供结构和功能支持。端细胞是大的间充质细胞,到目前为止主要通过电子显微镜描述为具有长细胞质过程的细胞,称为端足,它们重叠以形成迷宫网络3,4,5,6,7。最近,表达转录因子FOXL1的肠端细胞已成为提供Wnt蛋白的重要干细胞生态位成分,Wnt蛋白对干细胞和祖细胞功能至关重要。肠端细胞表达高水平的关键信号通路蛋白,如Wnt、Bmp、Tgfb和Shh,以及许多生长因子8。
鉴于端细胞是体内关键的干细胞生态位成分,开发离体分离和培养它们的方案将允许它们用作信号分子和生长因子的来源,以支持体外生长和分化。使用完善的方案,可以分离结肠或肠上皮隐窝并形成称为类器官的3D结构9,10,11。三维类器官是研究体外肠上皮生理和病理学的有力工具。在离体系统中,类器官依赖于外源性补充因子的生存和生长10。分离的间充质可以用小鼠和人源性类器官培养,并用作生长因子的来源,而不是外源性补充剂,以更好地反映原始组织中的情况。离体研究端细胞在更详细地研究正常或病理细胞行为、组织稳态机制和细胞间相互作用方面有许多好处。
尽管有描述如何从小鼠肠道中分离间充质的方案,但尚不清楚这些程序是否会导致端细胞的有效分离。成功分离端细胞需要特殊的方案调整,以允许解离端细胞和邻近细胞之间的强细胞 – 细胞接触,而不影响其活力。为了克服这些限制,本文提出了一种改进的方案,该方案始终如一地产生高度活泼的单细胞悬液,其中包含相对大量的具有足够保守的抗原和功能特性的端细胞。这些端细胞可用于多种应用,包括与小鼠或人源性类器官共培养,以支持生长而无需补充生长因子。这反过来又更好地反映了原始组织中的情况。
我们使用FOXL1-Cre:Rosa-mTmG小鼠模型8,其中端细胞用绿色绿色荧光蛋白(GFP)的膜结合版本标记,这允许研究人员跟踪整个端细胞;所有其他间充质细胞都用红色的膜结合tdTomato标记。目前的方案是从分离肠间充质12 的方案修改而来的,以提高端细胞产量和活力。
在这里,我们开发了一种使用FOXL1-Cre:Rosa26-mTmG小鼠模型从小鼠小肠中分离间充质的方案,该模型使研究人员能够将端细胞与其他间充质细胞区分开来。此协议中有一些关键步骤要遵循。首先,重要的是以四到五个周期/秒的速度剧烈摇动试管,以在间充质分离期间丢弃大部分上皮细胞。酶消化的孵育时间必须根据消化效率进行优化。在孵育期间,每20分钟轻轻水平摇动板几秒钟。一旦组织变成细丝状,必须通过继续方案步骤2.12来停止孵育。长时间暴露组织可能会导致细胞活力率和产量低。酶消化后,必须机械摇动管以释放更多的单细胞悬浮液;理想情况下,溶液应该看起来浑浊,并且不应该看到任何组织碎片。如果不是这种情况,请将酶消化延长至60分钟。
保持无菌条件并避免潜在的细菌污染是使用原代组织培养时的关键步骤之一。必须使用无菌解剖工具、试剂和缓冲液;与动物一起工作时必须更换手套,并且必须清洁工作区域。获得细胞悬液后,应在层流生物罩下进行工作。接种后,细胞应在不受干扰的情况下孵育过夜,因为这会影响粘附。此外,重要的是在接种后一天更换培养基,因为非贴壁细胞可能会影响培养活力。
本协议中使用的表面标志物与其表位发生强烈反应;然而,酶消化可能会影响结合反应性,因此影响FACS分析结果。该协议的另一个限制是肌肉层的代表性不足。为了提高肌肉层细胞分离的效率,我们建议将肌肉与粘膜层机械分离,并对每一层进行分离酶消化。为了将上皮与基质解离,可以使用机械分离剂或螯合剂(EDTA或DTT);然而,用于获得单细胞的酶消化已在该方案中得到优化。
肠道间充质的分离先前已有报道8;用盖玻片刮掉绒毛会导致绒毛旁边的一些间充质丢失,尤其是绒毛尖端间充质细胞,例如 Lgr5+ 绒毛尖端端细胞13。在该协议中,我们利用VIII型胶原酶而不是分散酶II和胰蛋白酶与DNase I相结合,因为胶原酶更有效地从基质中释放间充质细胞。虽然它延长了处理时间(>90分钟对35分钟),但两种方案产生了相似的细胞活力率;目前的方案一般提高了间充质细胞的产量,更具体地说是端细胞部分的产量。目前的方案产生约10%的GFP +端细胞,通过可视化和FACS分析确认,而早期的方案产生2%的GFP +端细胞。补充表S1列出了当前协议与两种参考协议之间的主要区别。
FOXL1 + GFP+细胞作为上皮下端细胞的鉴定基于体内研究。需要开发和修改可用的间充质分离方案以产生更高产量的端细胞,以及如何实现这一目标的知识是基于我们对体内FOXL1 +端细胞的结构和功能的理解,作为具有长细胞投影的大细胞紧密附着在上皮细胞上。
有趣的是, 离体 GFP+ 端细胞表现出与其 在肠道 体内特征相似的细胞特征,因此建议作为类器官生长的理想支持。尽管该协议主要讨论从小肠中分离端细胞,但可以使用具有微小修改的类似方案并轻松应用于结肠间充质细胞,例如最近描述的MAP3K2调节的肠基质细胞(MRISC)12。
一旦间充质细胞拉伸并达到汇合,它们就可以用于几种其他应用,例如使用无生长因子的基质胶与小鼠或人源类器官进行3D共培养。间充质通常形成一个完全支持类器官形成和生长的网络,无需补充外源性生长因子。肠基质具有固有的3D特征,可以为上皮提供机械支持14。因此,该协议也可用于分离间充质以集成到3D生物打印支架中,并用于进一步的异种移植实验。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了以色列科学基金会(MSC个人资助)的资助以及以色列科学基金会与中国国家自然科学基金的联合项目。
15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
Cell Lifter | Corning | 3008 | |
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
DNase I | Sigma | DN25-1G | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |