مزارع زراعة الشبكية ذات النمط العضوي من المكاك
Summary
تم استزراع نباتات الشبكية التي تم الحصول عليها من المكاك البرية في المختبر. تم تحفيز تنكس الشبكية ومسار إشارات cGMP-PKG باستخدام مثبط PDE6 zaprinast. تم التحقق من تراكم cGMP في النباتات بتركيزات مختلفة من zaprinast باستخدام التألق المناعي.
Abstract
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي. يؤدي الإفراط في تنشيط مسار بروتين كيناز (PKG) المعتمد على الغوانوزين الدوري (cGMP) في الخلايا المستقبلة للضوء إلى موت الخلايا المستقبلة للضوء ، خاصة في النماذج التي تؤوي طفرات فوسفوديستراز 6b (PDE6b). استخدمت الدراسات السابقة على RD بشكل أساسي نماذج الفئران مثل الفئران rd1 أو rd10 . بالنظر إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية بين الفئران والبشر ، من المهم أن نفهم إلى أي مدى يمكن مقارنة شبكية العين من الرئيسيات والقوارض. تشترك المكاك في مستوى عال من التشابه الجيني مع البشر. لذلك ، تم اختيار المكاك من النوع البري (الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات) للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية التي تضمنت مركب ظهارة الشبكية والشبكية (RPE) – المشيمية. تمت معالجة هذه النباتات بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast للحث على مسار إشارات cGMP-PKG ومحاكاة التسبب في RD. تم التحقق لاحقا من تراكم cGMP وموت الخلايا في نباتات شبكية الرئيسيات باستخدام التألق المناعي ومقايسة TUNEL. قد يعمل نموذج شبكية العين الرئيسيات الذي تم إنشاؤه في هذه الدراسة على الدراسات ذات الصلة والفعالة في آليات RD المعتمدة على cGMP-PKG ، وكذلك لتطوير مناهج العلاج المستقبلية.
Introduction
يتميز تنكس الشبكية الوراثي (RD) بموت الخلايا المستقبلة للضوء التدريجي وينتج عن طفرات في مجموعة واسعة من الجينات المسببة للأمراض1. النتيجة النهائية ل RD هي فقدان البصر وفي الغالبية العظمى من الحالات لا يزال المرض غير قابل للعلاج حتى يومنا هذا. لذلك ، من المهم دراسة الآليات الخلوية التي تؤدي إلى موت المستقبلات الضوئية باستخدام نماذج تمثل بأمانة حالة المرض البشري. هنا ، تعتبر النماذج القائمة على الرئيسيات ذات أهمية خاصة بسبب قربها من البشر. والجدير بالذكر أن مثل هذه النماذج قد تعزز تطوير التدخلات العلاجية المناسبة التي يمكن أن توقف أو تؤخر موت الخلايا المستقبلة للضوء.
أظهرت الأبحاث السابقة حول آليات موت الخلايا في RD أن انخفاض أو فقدان نشاط فسفوديستراز 6 (PDE6) الناجم عن طفرات الجينات المسببة ل RD يؤدي إلى انخفاض التحلل المائي لأحادي فوسفات الغوانوزين الدوري (cGMP) 2,3. cGMP هو ناهض محدد للقنوات الأيونية ذات البوابات النوكليوتيدات الدورية (CNGCs) في الأجزاء الخارجية للقضيب (ROSs) وهو أيضا جزيء رئيسي مسؤول عن تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية في خلايا مستقبلات الضوءالفقارية 4. يؤدي التحلل المائي المنخفض cGMP إلى تراكم cGMP في ROSs ، مما يؤدي إلى فتح CNGCs 5. وبالتالي ، يتم تنشيط مسارات النقل الضوئي ، مما يؤدي إلى زيادة تركيزات الكاتيون في الخلايا المستقبلة للضوء. تفرض هذه العملية عبئا أيضيا على المستقبلات الضوئية ، والتي عند الإفراط في تنشيطها ، على سبيل المثال ، بسبب الطفرات في PDE6 ، قد تسبب موت الخلايا.
أظهرت العديد من الدراسات أن التراكم المفرط الكبير ل cGMP في المستقبلات الضوئية لنماذج الفئران ذات الطفرات الجينية RD المختلفة قد يتسبب في تنشيط بروتين كيناز المعتمد على cGMP (PKG) 3,6. هذا يؤدي إلى زيادة كبيرة في الخلايا الميتة الإيجابية TUNEL وترقق تدريجي لطبقة الخلايا المستقبلة للضوء. تشير الدراسات السابقة إلى أن فرط نشاط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP هو شرط ضروري وكاف لتحريض موت الخلايا المستقبلة للضوء 2,5. أظهرت الدراسات التي أجريت على نماذج مختلفة من الفئران من RD أيضا أن تنشيط PKG الناجم عن ارتفاع مستويات cGMP في المستقبلات الضوئية ، يؤدي إلى الإفراط في تنشيط المستجيبات النهائية مثل بوليميراز بوليميراز بولي ADP – ريبوز 1 (PARP1) ، هيستون ديسيتيلاز (HDAC) ، وكالبين2،7،8،9. وهذا يعني وجود ارتباطات سببية بين هذه البروتينات المستهدفة المختلفة وموت الخلايا المستقبلة للضوء.
ومع ذلك ، استندت الأبحاث السابقة حول علم الأمراض وعلم السموم والعلاج من RD بشكل أساسي على نماذج الفئران ل RD10،11،12. ومع ذلك ، لا تزال هناك صعوبات هائلة في الترجمة السريرية لهذه النتائج. ويرجع ذلك إلى الاختلافات الجينية والفسيولوجية الكبيرة بين الفئران والبشر ، خاصة فيما يتعلق ببنية الشبكية. في المقابل ، تشترك الرئيسيات غير البشرية (NHPs) أيضا في درجة عالية من التشابه مع البشر فيما يتعلق بالخصائص الوراثية والأنماط الفسيولوجية وتنظيم العوامل البيئية. على سبيل المثال ، تم التحقيق في العلاج البصري الوراثي كوسيلة لاستعادة نشاط الشبكية في نموذج NHP13. أظهر لينغام وزملاؤه أن خلايا سلائف مستقبلات الشبكية الشبكية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات على مستوى ممارسات التصنيع الجيدة قد تنقذ تلف مستقبلات الضوء المخروطية في NHP14. لذلك ، تعد نماذج NHP مهمة لاستكشاف التسبب في RD وتطوير طرق علاج فعالة. على وجه الخصوص ، يمكن أن تلعب نماذج NHP من RD ، التي تظهر آليات مسببة للأمراض مماثلة لتلك الموجودة في البشر ، دورا حاسما في الدراسات المتعلقة بتطوير وتحليل علم الأدوية السمية في الجسم الحي للعقاقير الجديدة.
نظرا لدورة الحياة الطويلة ، والمستوى العالي من الصعوبات التقنية ، والتكلفة العالية التي ينطوي عليها إنشاء نماذج الرئيسيات في الجسم الحي ، أنشأنا نموذجا للرئيسيات غير البشرية في المختبر (NHP) باستخدام مزارع شبكية المكاك المزروعة. أولا ، تم اختيار المكاك من النوع البري الذين تتراوح أعمارهم بين 1-3 سنوات للاستزراع في المختبر لنباتات الشبكية ، والتي تضمنت مجمع شبكية العين RPE-choroid. ثم تمت معالجة النباتات الخارجية بتركيزات مختلفة من مثبط PDE6 zaprinast (100 ميكرومتر ، 200 ميكرومتر ، و 400 ميكرومتر) للحث على مسار إشارات cGMP-PKG. تم تحديد موت الخلايا المستقبلة للضوء وتحليلها باستخدام مقايسة TUNEL ، وتم التحقق من تراكم cGMP في النباتات الخارجية عن طريق التألق المناعي. نظرا لدرجة التشابه العالية فيما يتعلق بتوزيع الخلايا ومورفولوجيتها ، وسمك طبقة الشبكية ، والخصائص الفسيولوجية الأخرى لشبكية العين بين القرود والبشر ، فإن إنشاء مسار إشارات cGMP-PKG في نموذج الشبكية في المختبر قد يسهل البحث المستقبلي حول التسبب في RD وكذلك الدراسات في تطوير وعلم الأدوية السمية للعقاقير الجديدة لعلاج RD.
Protocol
Representative Results
Discussion
يشير النقل الضوئي البصري إلى العملية البيولوجية التي يتم من خلالها تحويل الإشارات الضوئية إلى إشارات كهربائية بواسطة خلايا مستقبلات ضوئية داخل شبكية العين. الخلايا المستقبلة للضوء هي خلايا عصبية مستقطبة قادرة على الانتقال الضوئي، وهناك نوعان مختلفان من المستقبلات الضوئية تسمى القضبان …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81960180) ، ومؤسسة تراث زينكي ، ومؤسسة شارلوت وتيستو كيرستان ، ومركز يونان الطبي السريري لأمراض العيون (ZX2019-02-01). نشكر البروفيسور Longbao Lv (معهد علم الحيوان ، الأكاديمية الصينية للعلوم ، كونمينغ ، الصين) لمشاركة مقل عيون القرد المستخدمة في هذه الدراسة.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O’Neal, T. B., Luther, E. E. . StatPearls. , (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration – Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
