Органотипические культуры экплантатов сетчатки макаки
Summary
Эксплантаты сетчатки, полученные от макак дикого типа, культивировали in vitro. Дегенерацию сетчатки и сигнальный путь цГМФ-ФКГ индуцировали с помощью ингибитора ФДЭ6 запринаста. Накопление цГМФ в эксплантах при различных концентрациях запринаста верифицировали с помощью иммунофлюоресценции.
Abstract
Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток. Чрезмерная активация пути циклической гуанозинмонофосфата (цГМФ)-зависимой протеинкиназы (PKG) в фоторецепторных клетках вызывает гибель фоторецепторных клеток, особенно в моделях, содержащих мутации фосфодиэстеразы 6b (PDE6b). В предыдущих исследованиях RD использовались в основном мышиные модели, такие как мыши rd1 или rd10 . Учитывая генетические и физиологические различия между мышами и людьми, важно понять, в какой степени сетчатка приматов и грызунов сопоставима. Макаки имеют высокий уровень генетического сходства с людьми. Таким образом, для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro были отобраны макаки дикого типа (в возрасте 1-3 лет), включающие комплекс сетчато-ретинальный пигментный эпителий (RPE)-сосудистая оболочка. Эти эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 для индукции сигнального пути цГМФ-ПКГ и моделирования патогенеза РД. Накопление цГМФ и гибель клеток в эксплантах сетчатки приматов были впоследствии проверены с помощью иммунофлюоресценции и анализа TUNEL. Модель сетчатки приматов, созданная в этом исследовании, может служить для актуальных и эффективных исследований механизмов цГМФ-PKG-зависимой РД, а также для разработки будущих подходов к лечению.
Introduction
Наследственная дегенерация сетчатки (РД) характеризуется прогрессирующей гибелью фоторецепторных клеток и обусловлена мутациями в широком спектре патогенных генов1. Конечным результатом РД является потеря зрения, и в подавляющем большинстве случаев болезнь остается неизлечимой по сей день. Поэтому важно изучать клеточные механизмы, приводящие к гибели фоторецепторов, используя модели, которые точно представляют состояние болезни человека. Здесь особый интерес представляют модели, основанные на приматах, из-за их близости к человеку. Примечательно, что такие модели могут способствовать разработке соответствующих терапевтических вмешательств, которые могут остановить или отсрочить гибель фоторецепторных клеток.
Предыдущие исследования механизмов гибели клеток при РД показали, что снижение или потеря активности фосфодиэстеразы 6 (ФДЭ6), вызванная мутациями генов, запускающих РД, приводит к снижению гидролиза циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ)2,3. цГМФ является специфическим агонистом циклических нуклеотид-управляемых ионных каналов (CNGC) во внешних сегментах стержней (АФК), а также ключевой молекулой, ответственной за преобразование световых сигналов в электрические сигналы в фоторецепторных клеткахпозвоночных 4. Восстановленный гидролиз цГМФ вызывает накопление цГМФ в АФК, что приводит к открытию КНГК 5. Следовательно, пути фототрансдукции активируются, что приводит к увеличению концентрации катионов в фоторецепторных клетках. Этот процесс налагает метаболическую нагрузку на фоторецепторы, которая при чрезмерной активации, например, мутациями в ФДЭ6, может вызвать гибель клеток.
Многие исследования показали, что значительное перенакопление цГМФ в фоторецепторах мышиных моделей с различными мутациями гена RD может вызывать активацию цГМФ-зависимой протеинкиназы (PKG)3,6. Это приводит к значительному увеличению умирающих, TUNEL-положительных клеток и постепенному истончению клеточного слоя фоторецепторов. Предыдущие исследования показывают, что гиперактивация ФКГ, вызванная повышенным уровнем цГМФ, является необходимым и достаточным условием для индукции гибели фоторецепторных клеток 2,5. Исследования на различных мышиных моделях РД также показали, что активация ПКГ, вызванная повышенными уровнями цГМФ в фоторецепторах, приводит к чрезмерной активации нижестоящих эффекторов, таких как поли-АДФ-рибоза-полимераза 1 (PARP1), гистондеацетилазы (HDAC) и кальпаин 2,7,8,9. Это подразумевает причинно-следственные связи между этими различными белками-мишенями и гибелью фоторецепторных клеток.
Однако предыдущие исследования патологии, токсикофармакологии и терапии РД были в основном основаны на мышиных моделях РД10,11,12. Тем не менее, остаются огромные трудности в клиническом переводе этих результатов. Это связано со значительными генетическими и физиологическими различиями между мышами и людьми, особенно в отношении структуры сетчатки. Напротив, нечеловекообразные приматы (NHP) также имеют высокую степень сходства с людьми в отношении генетических характеристик, физиологических моделей и регуляции факторов окружающей среды. Например, оптогенетическая терапия была исследована как средство восстановления активности сетчатки в моделиNHP 13. Лингам и его коллеги продемонстрировали, что индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки-предшественники сетчатки могут спасти повреждение колбочковых фоторецепторов в NHP14. Поэтому модели NHP важны для изучения патогенеза РД и разработки эффективных методов лечения. В частности, NHP-модели РД, демонстрирующие патогенные механизмы, сходные с таковыми у людей, могут сыграть решающую роль в исследованиях по разработке и токсикофармакологическому анализу in vivo новых лекарств.
Ввиду длительного жизненного цикла, высокого уровня технических трудностей и высоких затрат, связанных с созданием моделей приматов in vivo , мы создали модель инопланетных приматов (NHP) in vitro с использованием культур эксплантированной сетчатки макак. Во-первых, были отобраны макаки дикого типа в возрасте 1-3 лет для культивирования эксплантатов сетчатки in vitro , которые включали комплекс сетчатка-RPE-сосудистая оболочка. Затем эксплантаты обрабатывали различными концентрациями запринаста ингибитора ФДЭ6 (100 мкМ, 200 мкМ и 400 мкМ), чтобы индуцировать сигнальный путь цГМФ-ПКГ. Гибель фоторецепторных клеток была количественно определена и проанализирована с помощью анализа TUNEL, а накопление цГМФ в эксплантах было проверено с помощью иммунофлуоресценции. Учитывая высокую степень сходства в отношении распределения и морфологии клеток, толщины слоя сетчатки и других физиологических характеристик сетчатки у обезьян и человека, установление сигнального пути цГМФ-ПКГ в модели сетчатки in vitro может способствовать будущим исследованиям патогенеза РД, а также исследованиям в области разработки и токсикофармакологии новых препаратов для лечения РД.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуальная фототрансдукция относится к биологическому процессу, посредством которого световые сигналы преобразуются в электрические сигналы фоторецепторными клетками в сетчатке глаза. Фоторецепторные клетки представляют собой поляризованные нейроны, способные к фототрансдукции, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 81960180), Фонда наследия Зинкэ и Фонда Шарлотты и Тистоу Керстан, Юньнаньского клинического медицинского центра глазных болезней (ZX2019-02-01). Мы благодарим профессора Лунбао Лю (Институт зоологии Китайской академии наук, Куньмин, Китай) за то, что он поделился глазными яблоками обезьян, использованными в этом исследовании.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O’Neal, T. B., Luther, E. E. . StatPearls. , (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration – Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
