원숭이 원숭이의 Organotypic Retinal Explant 배양
Summary
야생형 원숭이로부터 얻은 망막 외식편을 시험관 내에서 배양하였다. 망막 변성 및 cGMP-PKG 신호전달 경로는 PDE6 억제제 zaprinast를 사용하여 유도하였다. 상이한 자프리나스트 농도에서 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광법을 사용하여 검증하였다.
Abstract
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 합니다. 광수용체 세포에서 고리형 구아노신 일인산(cGMP) 의존성 단백질 키나아제(PKG) 경로의 과활성화는 특히 포스포디에스테라제 6b(PDE6b) 돌연변이가 있는 모델에서 광수용체 세포 사멸을 유발합니다. RD에 대한 이전 연구에서는 주로 rd1 또는 rd10 마우스와 같은 쥐 모델을 사용했습니다. 생쥐와 인간의 유전 적, 생리 학적 차이를 감안할 때, 영장류와 설치류의 망막이 어느 정도 비슷한지를 이해하는 것이 중요합니다. 원숭이는 인간과 높은 수준의 유전적 유사성을 공유합니다. 따라서 망막-망막 색소 상피(RPE)-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 야생형 원숭이(1-3세)를 선택했습니다. 이들 외식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하고 RD 병인을 시뮬레이션하였다. 영장류 망막 외식편에서의 cGMP 축적 및 세포 사멸은 후속적으로 면역형광 및 TUNEL 분석을 사용하여 검증하였다. 이 연구에서 확립된 영장류 망막 모델은 cGMP-PKG 의존성 RD의 메커니즘에 대한 적절하고 효과적인 연구와 향후 치료 접근법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
Introduction
유전성 망막 변성(RD)은 진행성 광수용체 세포 사멸을 특징으로 하며 다양한 병원성 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다1. RD의 최종 결과는 시력 상실이며 대부분의 경우 질병은 오늘날까지 치료할 수 없습니다. 따라서, 인간의 질병 상태를 충실하게 나타내는 모델을 사용하여 광수용체 사멸로 이어지는 세포 메커니즘을 연구하는 것이 중요합니다. 여기서 영장류 기반 모델은 인간과의 친밀감 때문에 특히 중요합니다. 특히, 이러한 모델은 광수용체 세포 사멸을 중단시키거나 지연시킬 수 있는 적절한 치료 개입의 개발을 진전시킬 수 있습니다.
RD의 세포 사멸 메커니즘에 대한 이전 연구에서는 RD 유발 유전자 돌연변이로 인한 포스포디에스테라제 6(PDE6) 활성의 감소 또는 손실이 고리형 구아노신 일인산(cGMP)의 가수분해를 감소시킨다는 것을 입증했습니다.2,3. cGMP는 막대 바깥쪽 세그먼트(ROS)에 있는 고리형 뉴클레오티드 개폐 이온 채널(CNGCs)의 특이적 작용제이며, 척추동물 광수용체 세포에서 광 신호를 전기 신호로 변환하는 역할을 하는 핵심 분자이기도 하다4. cGMP 가수 분해가 감소하면 ROS에 cGMP가 축적되어 CNGC가 개방된다 5. 결과적으로, 광변환 경로가 활성화되어 광수용체 세포에서 양이온 농도가 증가합니다. 이 과정은 광수용체에 대사 부담을 부과하며, 예를 들어 PDE6의 돌연변이에 의해 과잉 활성화되면 세포 사멸을 유발할 수 있습니다.
많은 연구에서 RD 유전자 돌연변이가 다른 마우스 모델의 광수용체에서 cGMP의 상당한 과다 축적이 cGMP 의존성 단백질 키나아제(PKG)의 활성화를 유발할 수 있음을 보여주었습니다3,6. 이것은 죽어가는 TUNEL 양성 세포의 상당한 증가와 광수용체 세포층의 점진적인 얇아짐으로 이어집니다. 이전의 연구들은 상승된 cGMP 수치에 의한 PKG 과잉활성화가 광수용체 세포사멸의 유도를 위한 필요충분조건임을 시사한다 2,5. RD의 상이한 마우스 모델에 대한 연구는 또한 광수용체에서 상승된 cGMP 수준에 의해 유도된 PKG 활성화가 폴리-ADP-리보스 중합효소 1 (PARP1), 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 및 칼파인 2,7,8,9와 같은 다운스트림 이펙터의 과활성화를 유도한다는 것을 보여주었다. 이것은 이러한 서로 다른 표적 단백질과 광수용체 세포 사멸 사이의 인과 관계를 의미합니다.
그러나 RD의 병리학, 독성 약리학 및 치료에 대한 이전 연구는 주로 RD10,11,12에 대한 마우스 모델을 기반으로 했습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과의 임상 번역에는 엄청난 어려움이 남아 있습니다. 이것은 특히 망막 구조와 관련하여 생쥐와 인간 사이의 상당한 유전적, 생리학적 차이 때문입니다. 대조적으로, 비인간 영장류(NHP)는 유전적 특성, 생리학적 패턴 및 환경 요인 조절과 관련하여 인간과 높은 수준의 유사성을 공유합니다. 예를 들어, 광유전학적 요법은 NHP 모델13에서 망막 활성을 회복시키는 수단으로서 조사되었다. Lingam과 동료들은 우수 제조 관행 등급의 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 망막 광수용체 전구체 세포가 NHP14에서 원추형 광수용체 손상을 구제할 수 있음을 입증했습니다. 따라서 NHP 모델은 RD 발병기전의 탐색과 효과적인 치료 방법의 개발에 중요합니다. 특히, 인간과 유사한 병원성 기전을 나타내는 RD의 NHP 모델은 신약의 개발 및 생체 내 독성 약리학 분석에 대한 연구에서 중요한 역할을 할 수 있습니다.
긴 수명 주기, 높은 수준의 기술적 어려움 및 생체 내 영장류 모델 구축과 관련된 높은 비용을 고려하여 이식된 원숭이 망막의 배양을 사용하여 시험관 내 비인간 영장류(NHP) 모델을 확립했습니다. 먼저, 망막-RPE-맥락막 복합체를 포함하는 망막 외식편의 시험관 내 배양을 위해 1-3세의 야생형 원숭이를 선택했습니다. 이어서, 체외이식편을 상이한 농도의 PDE6 억제제 자프리나스트(100 μM, 200 μM 및 400 μM)로 처리하여 cGMP-PKG 신호전달 경로를 유도하였다. 광수용체 세포 사멸은 TUNEL 분석을 사용하여 정량화 및 분석하였으며, 외식편에서의 cGMP 축적은 면역형광을 통해 검증하였다. 원숭이와 인간 사이의 세포 분포 및 형태, 망막층 두께 및 망막의 기타 생리학적 특성과 관련하여 높은 수준의 유사성을 감안할 때, 시험관 내 망막 모델에서 cGMP-PKG 신호 전달 경로의 확립은 RD의 발병기전에 대한 향후 연구뿐만 아니라 RD 치료를 위한 신약의 개발 및 독성 약리학에 대한 연구를 촉진할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시각적 광변환은 눈의 망막 내에 있는 광수용체 세포에 의해 광 신호가 전기 신호로 변환되는 생물학적 과정을 말합니다. 광수용체 세포는 광변환이 가능한 편광 뉴런이며, 외부 세그먼트의 모양을 따서 간상체와 원뿔이라고 하는 두 가지 유형의 광수용체가 있습니다. 막대는 scotopic 시력을 담당하고 원뿔은 사진 및 고시력 시력을 담당합니다. 유전성 RD는 진행성 망막 광수용체 세포 사멸을 특징?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No. 81960180), Zinke 유산 재단, Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01)의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구에 사용된 원숭이 안구를 공유해 주신 Longbao Lv 교수(중국 쿤밍 중국과학원 동물학 연구소)에게 감사드립니다.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
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