Organotypiske retinale eksplantatkulturer fra Macaque Monkey
Summary
Retinale eksplanter opnået fra vildtype makaker blev dyrket in vitro. Retinal degeneration og cGMP-PKG-signalvejen blev induceret under anvendelse af PDE6-hæmmeren zaprinast. cGMP-akkumulering i eksplantaterne ved forskellige zaprinastkoncentrationer blev verificeret ved anvendelse af immunfluorescens.
Abstract
Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød. Overaktivering af den cykliske guanosinmonophosphat (cGMP)-afhængige proteinkinase (PKG) vej i fotoreceptorceller forårsager fotoreceptorcelledød, især i modeller, der huser phosphodiesterase 6b (PDE6b) mutationer. Tidligere undersøgelser af RD har hovedsageligt brugt murine modeller såsom rd1 eller rd10 mus. I betragtning af de genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker er det vigtigt at forstå, i hvilket omfang nethinden hos primater og gnavere er sammenlignelige. Makaker deler et højt niveau af genetisk lighed med mennesker. Derfor blev vildtypemakaker (i alderen 1-3 år) udvalgt til in vitro-kulturen af retinale eksplanter, der omfattede retina-retinal pigmentepitel (RPE)-choroidkomplekset. Disse eksplantater blev behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast for at inducere cGMP-PKG-signalvejen og simulere RD-patogenese. cGMP-akkumulering og celledød i primater retinale eksplantater blev efterfølgende verificeret ved hjælp af immunofluorescens og TUNEL-assayet. Den primat-retinale model, der er etableret i denne undersøgelse, kan tjene til relevante og effektive undersøgelser af mekanismerne bag cGMP-PKG-afhængig RD samt til udvikling af fremtidige behandlingsmetoder.
Introduction
Arvelig retinal degeneration (RD) er karakteriseret ved progressiv fotoreceptorcelledød og er forårsaget af mutationer i en lang række patogene gener1. Slutresultatet af RD er synstab, og i langt de fleste tilfælde forbliver sygdommen uhelbredelig den dag i dag. Derfor er det vigtigt at studere de cellulære mekanismer, der fører til fotoreceptordød ved hjælp af modeller, der trofast repræsenterer den menneskelige sygdomstilstand. Her er primatbaserede modeller af særlig interesse på grund af deres nærhed til mennesker. Sådanne modeller kan især fremme udviklingen af passende terapeutiske indgreb, der kan standse eller forsinke fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i mekanismerne for celledød i RD har vist, at faldet eller tabet af phosphodiesterase 6 (PDE6) aktivitet forårsaget af RD-udløsende genmutationer fører til reduceret hydrolyse af cyklisk guanosinmonophosphat (cGMP)2,3. cGMP er en specifik agonist af de cykliske nukleotid-gated ionkanaler (CNGC’er) i stangens ydre segmenter (ROS’er) og er også et nøglemolekyle, der er ansvarlig for omdannelsen af lyssignaler til elektriske signaler i hvirveldyrs fotoreceptorceller4. Reduceret cGMP-hydrolyse forårsager akkumulering af cGMP i ROS’er, hvilket fører til åbning af CNGC’er 5. Følgelig aktiveres fototransduktionsvejene, hvilket resulterer i en stigning i kationkoncentrationer i fotoreceptorceller. Denne proces pålægger fotoreceptorer en metabolisk byrde, som, når de overaktiveres, for eksempel af mutationer i PDE6, kan forårsage celledød.
Mange undersøgelser har vist, at en signifikant overakkumulering af cGMP i fotoreceptorer i musemodeller med forskellige RD-genmutationer kan forårsage aktivering af cGMP-afhængig proteinkinase (PKG)3,6. Dette fører til en betydelig stigning i døende, TUNEL-positive celler og en gradvis udtynding af fotoreceptorcellelaget. Tidligere undersøgelser tyder på, at PKG-overaktivering forårsaget af forhøjede cGMP-niveauer er en nødvendig og tilstrækkelig betingelse for induktion af fotoreceptorcelledød 2,5. Undersøgelser af forskellige musemodeller af RD har også vist, at PKG-aktivering induceret af forhøjede cGMP-niveauer i fotoreceptorer fører til overaktivering af downstream-effektorer såsom poly-ADP-ribosepolymerase 1 (PARP1), histon-deacetylase (HDAC) og calpain 2,7,8,9. Dette indebærer årsagssammenhænge mellem disse forskellige målproteiner og fotoreceptorcelledød.
Tidligere forskning i patologi, toksikofarmakologi og terapi af RD var imidlertid hovedsageligt baseret på musemodeller for RD10,11,12. Ikke desto mindre er der stadig enorme vanskeligheder med den kliniske oversættelse af disse resultater. Dette skyldes de betydelige genetiske og fysiologiske forskelle mellem mus og mennesker, især med hensyn til nethindestrukturen. I modsætning hertil deler ikke-menneskelige primater (NHP’er) også en høj grad af lighed med mennesker med hensyn til genetiske egenskaber, fysiologiske mønstre og miljøfaktorregulering. For eksempel blev optogenetisk terapi undersøgt som et middel til at genoprette retinal aktivitet i en NHP model13. Lingam og kolleger demonstrerede, at god fremstillingspraksis-grade human-induceret pluripotent stamcelle-afledte retinale fotoreceptor precursor celler kan redde keglefotoreceptorskader i NHP14. Derfor er NHP-modeller vigtige for udforskningen af RD-patogenese og udviklingen af effektive behandlingsmetoder. Især NHP-modeller af RD, der udviser patogene mekanismer svarende til dem hos mennesker, kunne spille en kritisk rolle i undersøgelser af udviklingen og in vivo toksikofarmakologisk analyse af nye lægemidler.
I betragtning af den lange livscyklus, det høje niveau af tekniske vanskeligheder og de høje omkostninger, der er forbundet med at etablere in vivo-primatmodeller, etablerede vi en in vitro non-human primat (NHP) model ved hjælp af kulturer af udplantet makaknethinden. For det første blev vildtype makaker i alderen 1-3 år udvalgt til in vitro-kultur af retinale eksplanter, som omfattede retina-RPE-choroid-komplekset. Explants blev derefter behandlet med forskellige koncentrationer af PDE6-hæmmeren zaprinast (100 μM, 200 μM og 400 μM) for at inducere cGMP-PKG-signalvejen. Fotoreceptorcelledød blev kvantificeret og analyseret ved hjælp af TUNEL-assayet, og cGMP-akkumulering i eksplantater blev verificeret via immunofluorescens. I betragtning af den høje grad af lighed med hensyn til cellefordeling og morfologi, retinal lagtykkelse og andre fysiologiske egenskaber ved nethinden mellem aber og mennesker kan etableringen af cGMP-PKG-signalvejen i in vitro retinalmodellen lette fremtidig forskning i patogenesen af RD samt undersøgelser af udvikling og toksikofarmakologi af nye lægemidler til RD-behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visuel fototransduktion refererer til den biologiske proces, hvorved lyssignaler omdannes til elektriske signaler af fotoreceptorceller i øjets nethinden. Fotoreceptorceller er polariserede neuroner, der er i stand til fototransduktion, og der er to forskellige typer fotoreceptorer kaldet stænger og kegler efter formerne på deres ydre segmenter. Stænger er ansvarlige for det skotopiske syn, og kegler er ansvarlige for fotopisk og høj skarphedssyn. Arvelig RD vedrører neurodegenerative sygdomme karakteriseret ved pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81960180), Zinke Heritage Foundation og Charlotte and Tistou Kerstan Foundation, Yunnan Eye Disease Clinical Medical Center (ZX2019-02-01). Vi takker professor Longbao Lv (Institut for Zoologi, Chinese Academy of Sciences, Kunming, Kina) for at dele de abeøjeæbler, der blev brugt i denne undersøgelse.
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | Blocking solution |
| Corticosterone | Sigma | C2505 | Supplements of Complete Medium |
| DL-tocopherol | Sigma | T1539 | Supplements of Complete Medium |
| Donkey anti sheep, Alxea Fluor 488 | Life technologies corporation | A11015 | Secondary antibody of cGMP |
| Ethanol-acetic acid solution | Shyuanye | R20492 | Fixing liquid |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 900-108 | Blocking solution |
| Fluorescence microscope | Carl Zeiss | Axio Imager.M2 | Immunofluorescence imaging |
| Glutamine | Sigma | G8540 | Supplements of Complete Medium |
| Glutathione | Sigma | G6013 | Supplements of Complete Medium |
| In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red | Roche | 12156792910 | TUNEL assay |
| Insulin | Sigma | 16634 | Supplements of Complete Medium |
| L-cysteine HCl | Sigma | C7477 | Supplements of Complete Medium |
| Linoleic acid | Sigma | L1012 | Supplements of Complete Medium |
| MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi | 130-100-008 | Optimized storage of fresh organ and tissue samples |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking solution |
| Paraformaldehyde(PFA) | Biosharp | BL539A | Fixing agent |
| PEN. / STREP. 100× | Millipore | TMS-AB2-C | Penicillin / Streptomycin antibiotics |
| Phosphate buffer saline(PBS) | Solarbio | P1010 | Buffer solution |
| Povidone-iodine | Shanghailikang | 310411 | Disinfector agent |
| Progesterone | Sigma | P8783 | Supplements of Complete Medium |
| Proteinase K | Millpore | 539480 | Break down protein |
| R16 medium | Life technologies corporation | 074-90743A | Basic medium |
| Retinol | Sigma | R7632 | Supplements of Complete Medium |
| Retinyl acetate | Sigma | R7882 | Supplements of Complete Medium |
| Sheep anti-cGMP | Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands | Primary antibody of cGMP | |
| Sucrose | GHTECH | 57-50-1 | Dehydrating agent |
| T3 | Sigma | T6397 | Supplements of Complete Medium |
| Tissue-Tek medium (O.C.T. Compound) | SAKURA | 4583 | Embedding medium |
| Tocopheryl acetate | Sigma | T1157 | Supplements of Complete Medium |
| Transferrin | Sigma | T1283 | Supplements of Complete Medium |
| Transwell | Corning Incorporated | 3412 | Cell / tissue culture |
| Tris-buffer (TBS) | Solarbio | T1080 | Blocking buffer |
| Triton X-100 | Solarbio | 9002-93-1 | Surface active agent |
| VECTASHIELD Medium with DAPI | Vector | H-1200 | Mounting medium |
| Vitamin B1 | Sigma | T1270 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | Supplements of Complete Medium |
| Vitamin C | Sigma | A4034 | Supplements of Complete Medium |
| Zaprinast | Sigma | Z0878 | PDE6 inhibitor |
| Zeiss Imager M2 Microscope | Zeiss, Oberkochen,Germany | upright microscope | |
| LSM 900 Airyscan | high resolution laser scanning microscope | ||
| Zeiss Axiocam | Zeiss, Oberkochen,Germany | digital camera | |
| Zeiss Axiovision4.7 | |||
| Adobe | |||
| Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA) | |||
| Primate eyeballs from wildtype macaque | KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY | SYXK ( ) K2017 -0008 |
|
| Super Pap Pen Pen (Liquid Blocker, Diado, 0010, Japan | |||
| TUNEL kit solution (REF12156792910, Roche,Germany), |
References
- O’Neal, T. B., Luther, E. E. . StatPearls. , (2022).
- Power, M., et al. Cellular mechanisms of hereditary photoreceptor degeneration – Focus on cGMP. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100772 (2020).
- Paquet-Durand, F., Hauck, S. M., van Veen, T., Ueffing, M., Ekström, P. PKG activity causes photoreceptor cell death in two retinitis pigmentosa models. Journal of Neurochemistry. 108 (3), 796-810 (2009).
- Tolone, A., Belhadj, S., Rentsch, A., Schwede, F., Paquet-Durand, F. The cGMP pathway and inherited photoreceptor degeneration: Targets, compounds, and biomarkers. Genes (Basel). 10 (6), 453 (2019).
- Arango-Gonzalez, B., et al. Identification of a common non-apoptotic cell death mechanism in hereditary retinal degeneration. PLoS One. 9 (11), 112142 (2014).
- Mencl, S., Trifunović, D., Zrenner, E., Paquet-Durand, F. PKG-dependent cell death in 661W cone photoreceptor-like cell cultures (experimental study). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1074, 511-517 (2018).
- Power, M. J., et al. Systematic spatiotemporal mapping reveals divergent cell death pathways in three mouse models of hereditary retinal degeneration. Journal of Comparative Neurology. 528 (7), 1113-1139 (2020).
- Sancho-Pelluz, J., et al. Excessive HDAC activation is critical for neurodegeneration in the rd1 mouse. Cell Death & Disease. 1 (2), 24 (2010).
- Kulkarni, M., Trifunović, D., Schubert, T., Euler, T., Paquet-Durand, F. Calcium dynamics change in degenerating cone photoreceptors. Human Molecular Genetics. 25 (17), 3729-3740 (2016).
- Trifunović, D., et al. cGMP-dependent cone photoreceptor degeneration in the cpfl1 mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 518 (17), 3604-3617 (2010).
- Samardzija, M., et al. HDAC inhibition ameliorates cone survival in retinitis pigmentosa mice. Cell Death & Differentiation. 28 (4), 1317-1332 (2021).
- Schön, C., et al. Gene therapy successfully delays degeneration in a mouse model of PDE6A-linked Retinitis Pigmentosa (RP43). Human Gene Therapy. 28 (12), 1180-1188 (2017).
- McGregor, J. E., et al. Optogenetic therapy restores retinal activity in primate for at least a year following photoreceptor ablation. Molecular Therapy. 30 (3), 1315-1328 (2022).
- Lingam, S., et al. cGMP-grade human iPSC-derived retinal photoreceptor precursor cells rescue cone photoreceptor damage in non-human primates. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 464 (2021).
- Das, S., et al. The role of cGMP-signalling and calcium-signalling in photoreceptor cell death: perspectives for therapy development. Pflugers Archiv. 473 (9), 1411-1421 (2021).
- Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. Functional architecture of the retina: Development and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).
- Schnichels, S., et al. Retina in a dish: Cell cultures, retinal explants and animal models for common diseases of the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 81, 100880 (2021).
- Maryam, A., et al. The molecular organization of human cGMP specific Phosphodiesterase 6 (PDE6): Structural implications of somatic mutations in cancer and retinitis pigmentosa. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 378-389 (2019).
- Huang, L., Kutluer, M., Adani, E., Comitato, A., Marigo, V. New in vitro cellular model for molecular studies of retinitis pigmentosa. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6440 (2021).
- Zhou, J., Rasmussen, M., Ekström, P. cGMP-PKG dependent transcriptome in normal and degenerating retinas: Novel insights into the retinitis pigmentosa pathology. Experimental Eye Research. 212, 108752 (2021).
