Studio delle funzioni e delle attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2 mediante Western Blotting

Summary

Il presente protocollo evidenzia l’applicazione della tecnica western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K-Cl KCC2. Il protocollo descrive lo studio della fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007 tramite western blotting. Inoltre, ulteriori metodi per confermare l’attività di KCC2 sono brevemente evidenziati in questo testo.

Abstract

I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell’omeostasi della Cl^– e di conseguenza l’inibizione funzionale GABAergica. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è deleterio ed è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l’epilessia. Sono stati compiuti notevoli progressi per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolamentazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell’attività GABA). Qui, il protocollo evidenzia come studiare la fosforilazione di KCC2 nei siti regolatori delle chinasi – Thr906 e Thr1007 – utilizzando la tecnica del western blotting. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l’attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l’attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell’omeostasi intracellulare degli ioni cloruro. Alcune di queste tecniche aggiuntive saranno brevemente discusse in questo manoscritto.

Introduction

I cotrasportatori di cloruro di potassio 2 (KCC2) sono un membro della famiglia dei trasportatori di soluti 12 (SLC12) dei cotrasportatori catione-cloruro-cloruro (CCC), che si trovano esclusivamente nel neurone ed è essenziale per il corretto funzionamento dell’omeostasi della Cl^– e di conseguenza l’inibizione funzionale GABAergica 1,2,3,4. Il mantenimento di una bassa concentrazione intraneuronale di Cl- ([Cl-]_i) a 4-6 mM da parte di KCC2 facilita l’iperpolarizzazione dell’acido ^{γ-aminobutirrico} (GABA)/glicina e l’inibizione sinaptica nel cervello e nel midollo spinale⁵. Il fallimento nella corretta regolazione di KCC2 è stato associato alla prevalenza di diverse malattie neurologiche, tra cui l’epilessia⁴. Inoltre, la diminuzione dell’estrusione di Cl⁻ mediata da KCC2 e le alterate correnti iperpolarizzanti GABA_A e/o mediate dal recettore della glicina sono state implicate nell’epilessia, nel dolore neuropatico e nella spasticità ^6,7. Il KCC2 neuronale è modulato negativamente attraverso la fosforilazione di residui regolatori chiave all’interno del suo dominio intracellulare C-terminale^{dal complesso di} segnalazione della chinasi 1 senza lisina (WNK)-STE20/SPS1 correlato alla prolina/alanina (SPAK)/Oxidative stress-responsive (OSR), che facilita il mantenimento dell’attività depolarizzata del GABA nei neuroni immaturi ^2,8,9 . Il WNK-SPAK/OSR1 fosforila i residui di treonina 906 e 1007 (Thr906/Thr1007) e successivamente sottoregola l’espressione genica dell’mRNA di KCC2, portando ad un conseguente deterioramento della sua funzione fisiologica ^8,10. Ancora più importante, tuttavia, è già un dato di fatto che il complesso chinasico WNK-SPAK/OSR1 è noto per fosforilare e inibire l’espressione di KCC2 1,2,4,11,12, e che l’inibizione delle vie di segnalazione del complesso chinasico al fosforilato Thr906/Thr1007 è stata collegata con l’aumentata espressione del gene mRNA KCC2 ^13,14,15 . È importante notare che la regolazione dell’espressione neuronale dei cotrasportatori KCC2 e Na+-K⁺-2Cl^– 1 (NKCC1) attraverso la fosforilazione proteica funziona in concomitanza e in pattern inversi 1,4,16.

Sono stati compiuti progressi consistenti e considerevoli per quanto riguarda la comprensione dei meccanismi coinvolti nella regolazione del KCC2, accreditato allo sviluppo di tecniche che consentano ai ricercatori di studiarne le funzioni e le attività; tramite indagini dirette (valutazione della fosforilazione dei siti regolatori delle chinasi) o indirette (osservazione e monitoraggio dell’attività GABA). Il protocollo qui presentato evidenzia l’applicazione di tecniche di western blotting per studiare le funzioni e le attività del co-trasportatore neuronale K⁺-Cl^– KCC2 studiando la fosforilazione del cotrasportatore nei siti regolatori delle chinasi Thr906/1007.

Western blot è un metodo utilizzato per rilevare specifiche proteine di interesse da un campione di tessuto o cellula. Questo metodo separa prima le proteine per dimensione attraverso l’elettroforesi. Le proteine vengono quindi trasferite elettroforeticamente su un supporto solido (di solito una membrana) prima che la proteina bersaglio venga marcata utilizzando un anticorpo specifico. Gli anticorpi sono coniugati a diversi tag o anticorpi coniugati con fluorofori che vengono rilevati utilizzando metodi colorimetrici, chemiluminescenza o fluorescenza. Ciò consente di rilevare una specifica proteina bersaglio da una miscela di proteine. Questa tecnica è stata utilizzata per caratterizzare i siti fosfospecifici di KCCs¹ ed è stata utilizzata per identificare inibitori delle chinasi che inibiscono la fosforilazione di KCC3 Thr991/Thr1048¹⁷. Seguendo questo protocollo, si può rilevare specificamente KCC2 totale e fosforilato da lisati cellulari/tissutali. In linea di principio, la rilevazione di anticorpi coniugati con proteine mediante questa tecnica è altamente strumentale in quanto aiuta a migliorare la comprensione delle attività cooperative nei fosfo-siti di KCC2, che fa luce sui meccanismi molecolari coinvolti nelle loro regolazioni fisiologiche. L’analisi quantitativa dell’espressione proteica totale è rappresentativa della funzione e dell’attività di KCC2. Esistono altri metodi classici utilizzati per misurare direttamente l’attività di KCC2, come lo ione rubidio e il saggio di assorbimento degli ioni tallio. Ulteriori tecniche come patch-clamp-elettrofisiologia sono utilizzate per misurare l’attività GABA; quindi, riflettendo indirettamente KCC2 attivato e/o inattivato come informato dalla valutazione dell’omeostasi intracellulare degli ioni cloruro.

Protocol

NOTA: Il protocollo descrive il metodo western blotting per rilevare specifiche proteine di interesse. 1. Coltura cellulare e trasfezione Riscaldare tutti i reagenti nel bagno di perline (37 °C) prima della procedura di coltura cellulare. Preparare terreno di coltura, Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero bovino fetale, l’1% ciascuno di 2mM L-glutammina, 100x aminoacido non essenziale, 100 mM di piruvato di sodio e 100 unità / mL d…

Representative Results

Qui, il risultato rappresentativo presentato in Figura 1 ha studiato l’impatto di staurosporina e NEM sulla fosforilazione mediata da WNK-SPAK/OSR1 di KCC2 e NKCC1 in linee cellulari HEK293 che esprimono stabilmente KCC2b (HEKrnKCC2b)18 utilizzando la tecnica western blotting. Dettagli completi sui risultati rappresentativi sono discussi in Zhang et al.15. Simile al NEM, la staurosporina è un ampio inibitore della chinasi c…

Discussion

Molti metodi sono stati utilizzati per misurare le attività di SLC12 delle CCC che sono espresse nei neuroni, tra cui KCC2. Molte di queste tecniche hanno dimostrato di migliorare le conoscenze scientifiche sull’analisi della rilevanza funzionale di questi trasportatori e dei loro modelli struttura-funzione in diverse mutazioni correlate alla malattia. Criticamente, ci sono vantaggi e avvertimenti per i vari metodi²¹. Tuttavia, il protocollo spiegato sopra, ha delineato come valutare la fosforila…

Materials

40% acrylamide	Sigma-Aldrich	A2917	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Ammonium Per Sulfate	Sigma-Aldrich	248614	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
anti pSPAK	Dundee University	S670B	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2	Dundee University	S700C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pSer940	Thermo Fisher Scientific	PA5-95678	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr1007	Dundee University	S961C	Used as primary antibody for western blotting
anti-KCC2 pThr906	Dundee University	S959C	Used as primary antibody for western blotting
anti-mouse	Cell Signalling technology	66002	Used as secondary antibody for western blotting
anti-NKCC1	Dundee University	S841B	Used as primary antibody for western blotting
anti-NKCC1 pThr203/207/212	Dundee University	S763B	Used as primary antibody for western blotting
anti-rabbit	Cell Signalling technology	C29F4	Used as secondary antibody for western blotting
anti-sheep	abcam	ab6900	Used as secondary antibody for western blotting
anti-SPAK	Dundee University	S669D	Used as primary antibody for western blotting
anti-β-Tubulin III	Sigma-Aldrich	T8578	Used as primary antibody for western blotting
Benzamine	Merck UK	135828	Used as component of lysis buffer
Beta-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Used as component of loading buffer and lysis buffer
Bradford Coomasie	Thermo Scientific	1856209	Used for lysate protein quantification
Casting apparatus	Atto	WSE-1165W	Used to run SDS-page electrophoresis
Centrifuge	Eppendorf	5804	Used in lysate preparation
Centrifuge	VWR	MicroStar 17R	Used for spinning samples
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	Used for cell culture experiment
Dried Skimmed Milk	Marvel	N/A	Used to make blocking buffer
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose	Sigma-Aldrich	D6429	Used for cell culture
ECL reagent	Perkin Elmer	ORTT755/2655	Used to develop image for western blotting
EDTA	Fisher Scientific	D/0700/53	Used as component of lysis buffer
EGTA	Sigma-Aldrich	e4378	Used as component of lysis buffer
Electrophoresis Power Supply	BioRad	PowerPAC HC	To supply power to run SDS-page electrophoresis
Ethanol	ThermoFisher	E/0650DF/17	Used for preparing sterilized equipments and environment
Fetal Bovine Serum -  heat inactivated	Merck Life Sciences UK	F9665	Used for cell culture
Fumehood	Walker	A7277	Used for cell culture
Gel Blotting – Whatman	GE Healthcare	10426981	Used in western blotting to make transfer sandwich
Glycine	Sigma-Aldrich	15527	Used to make buffers
GraphPad Prism Software	GraphPad Software, Inc., USA	Version 6.0	Used for plotting graphs and analysing data for  western blotting
HCl	Acros Organics	10647282	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Heating block	Grant	QBT1	Used to heat WB loading samples
HEK293 cells	Merck UK	12022001-1VL	Cell line for culture experiment
ImageJ Software	Wayne Rasband and Contributors; NIH, USA	ImageJ 1.53e	Used to measure band intensities from western blotting images
Imaging system	BioRad	ChemiDoc MP	Used to take western blotting images
Incubator	LEEC	LEEC precision 190D	Used for cell culture
Isopropanol	Honeywell	24137	Used in casting gel for electrophoresis
L-glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513	Used for cell culture
Lithium dodecyl sulfate (LDS)	Novex	NP0008	Used as loading buffer for western blotting
MEM Non-essential amino acid	Merck Life Sciences UK	M7145	Used for cell culture
Microcentrifuge	Eppendorf	5418	Used for preparing lysates for WB
Microplate reader	BioRad	iMark	Used for lysate protein concentration readout
Microsoft Powerpoint	Microsoft, USA	PowerPoint2016	Used to edit western blotting images
Molecular Weight Marker	BioRad	1610373	Used for western blotting
N-ethylmaleimide	Thermo Fisher Scientific	23030	Used for cell culture experiment
Nitrocellulose membrane	Fisher Scientific	45004091	Used for western blotting
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Used for cell culture
pH Meter	Mettler Toledo	Seven compact s210	Used to monitor pH of buffer solutions
Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	Used as component of lysis buffer
Phosphate Buffer Saline	Sigma-Aldrich	D8537	Used for cell culture
PKCδ pThr505	Cell Signalling technology	9374	Used as primary antibody for western blotting
Sepharose Protein G	Generon	PG50-00-0002	Used for immunoprecipitation
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used as component of wash buffer
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S7653	Used to prepare TBS-T buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L5750	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
sodium orthovanadate	Sigma-Aldrich	S6508	Used as component of lysis buffer
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	S8636	Used for cell culture
sodium-β-glycerophosphate	Merck UK	G9422	Used as component of lysis buffer
Staurosporine (from Streptomyces sp.)	Scientific Laboratory Supplies, UK	S4400-1MG	Used for cell culture experiment
Sucrose	Scientifc Laboratory Supplies	S0389	Used as component of lysis buffer
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Transfer Chamber	BioRad	1658005EDU	Used in western blotting to transfer protein on membrane
Tris	Sigma-Aldrich	T6066	Used to make seperating and stacking gel for SDS-PAGE
Triton-X100	Sigma-Aldrich	T8787	Used as component of lysis buffer
Trypsin-EDTA Solution	Merck Life Sciences UK	T4049	Used for cell culture
Tween-20	Sigma-Aldrich	P3179	Used as make TBS-T buffer
Vacuum pump	Charles Austen	Dymax 5	Used for cell culture
Vortex	Scientific Industries	K-550-GE	Used in sample preparation
Vortex mixer	Scientific Industries Ltd	Vortex-Genie  K-550-GE	Used of mixing resolved sample
Water bath	Grant Instruments Ltd. (JB Academy)	JBA5	Used to incubate solutions